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1、荧光的简介及其应用荧光的简介及其应用 日常生活中荧光类物品随处可见，在自然科学中它也同样做出了巨大的贡献。荧光吸收了外界能量后，能发出不同波长和不同强度的光，一旦外界能源消失，则荧光也随之消失。可用荧光这一特性进行荧光分析检测以及生物探针的标记。 荧光 荧光分析 DNA 蛋白质 日常生活中荧光类物品随处可见，荧光笔，荧光粉，荧光板，荧光灯，这些日常用品在为我们带来便捷的同时也给予了我们美的享受。荧光究竟是什么物质，它在自然科学中又有哪些应用呢，下面让我们对荧光进行更深入的探究。 一 荧光的简介 自然界存在这样一类物质，当吸收了外界能量后，能发出不同波长和不同强度的光，一旦外界能源消失，则这种光
2、也随之消失，这种光称为荧光。 外界提供能量的方式有多种，如光照、加热、化学反应及生物代谢等。根据激发光的波长不同，荧光可分为射线荧光、紫外可见荧光和红外荧光等。根据发射荧光的粒子不同，荧光又可分为分子荧光和原子荧光，由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光的波长和发射光的波长也不同。 二 荧光的产生 物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级，成为激发单重态分子。激发态分子不稳定，可以通过以下几种途径释放能量返回基态： 一 振动驰豫 这一过程只能发生在同一电子能级内，即分子通过碰撞以热的形式损失部分
3、能量，从较高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上。由于这一部分能量以热的形式释放，而不是以光辐射形式发出，故振动驰豫属于无辐射跃迁。 二内转换 即激发态分子将多余的能量转变为热能，从较高电子能级降至较低的电子能级。内转换也属于无辐射跃迁。 三荧光 较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低振动能级后，仍不稳定，停留较短时间后，以光辐射形式放出能量，回到基态各振动能级，这时所发射的光称为荧光。当然也可以无辐射跃迁形式返回基态。 四系间窜跃 有些物质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态，这一过程伴随着自旋方
4、向的改变，称为系间窜跃。对于大多数物质，系间窜跃是禁阻的。如果分子中有重原子存在，由于自旋-轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜跃就变得容易了。 五磷光 经系间窜跃的分子再通过振动驰豫降至激发三重态的最低振动能级，停留一段时间，然后以光辐射形式放出能量返回到基态各振动能级，这时发出的光称为磷光。由于激发三重态能量比激发单重态最低振动能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，即磷光的波长比荧光更长。 三 荧光的检测 光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。样品发出的荧光为宽带光谱，需通过发射单色器分光后再进入检测器，检测不同发射波长下的
5、荧光强度F。由于激发光不可能完全被吸收，可透过溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向检测荧光。 四 激发光谱与荧光光谱的形成 任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱和荧光发射光谱。 激发光谱 保持荧光发射波长不变，依次改变激发光波长，测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F。然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同的是纵坐标。 荧光光谱 荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波长不变，依次改变荧光发射波长，测定
6、样品在不同波长处发射的荧光强度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，得到荧光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长。 五 荧光分析法的应用 有机物的荧光分析 由于荧光分析的高灵敏度、高选择性，使它在医学检验、卫生检验、药物分析、环境检测及食品分析等方面有广泛的应用。 芳香族及具有芳香结构的物质，在紫外光照射下能产生荧光。因此，荧光分析法可直接用于这类有机物的测定，如：多环胺类、萘酚类、嘌呤类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸及蛋白质等，约有200多种。 食品中维生素含量的测定是食品分析的常规项目，几乎所有种类的维生素都可以用荧光法进行分析
7、。多环芳烃普遍存在于大气、水、土壤、动植物及加工食品中，大家所熟知的苯并a芘是致癌活性最强的一种，通过萃取或色谱分离后，可采用荧光法进行测定。该方法准确可靠，测定最低浓度可达 0.1 mg/ml。 无机元素的荧光分析 能产生荧光的无机物较少，对其进行分析通常是将待测元素与荧光试剂反应，生成具有荧光特性的配合物，进行间接测定。目前利用该法可进行荧光分析的无机元素已近70种。常见的有铬、铝、铍、硒、锗、镉等及部分稀土元素。 例如Al3+与桑色素或8-羟基喹啉的配合物就可产生荧光，从而用于铝的测定。有些元素虽不能与有机试剂形成能产生荧光的配合物，但它可使荧光物质的荧光熄灭。例如F-离子在一定pH的溶
8、液中，能从Al3+与桑色素的荧光配合物中夺取Al3+，从而导致荧光配合物的荧光强度降低，其荧光强度与F-离子的浓度成反比，利用这一性质可间接测定样品中的氟离子含量。 六 分子荧光在生命科学中的应用 DNA分子荧光探针 DNA是生命遗传的重要物质，DNA分子的定量分析、特异识别，对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。由于生物分子自身的荧光较弱，目前多采用荧光探针法检测。荧光探针法较传统的同位素检测快速，重复性好，用样量少，无辐射，在DNA自动测序，抗体免疫分析，疾病诊断，抗癌药物分析等方面已得到广泛应用。DNA荧光探针的灵敏度是影响检测结果的重要因素，因而开发出更灵敏
9、的荧光探针，同时避免生物荧光背景的干扰已成为目前研究的热点。 DNA分子荧光探针可分为吖啶、菲啶类；菁类染料；荧光素和罗丹明类；稀土元素探针和量子点荧光探针。目前，DNA荧光探针要解决的问题是提高灵敏度，增强光稳定性，降低合成成本。不同的DNA荧光探针各有优缺电，有机类染料中近红外染料具有一定的优势，尤其是近红外菁染料将会更多的被合成并应用于生物分子的榆测，其光稳定性有待提高。量子点探针作为一个新兴领域，必将受到越来越多的重视。相信不久的将来，随着新型、性能优异的荧光探针的开发，人类将能够实现对一些生物过程运用多种方法、多种参数进行实时观测、动态研究，这极大地推动基因组学及相关学科的发展。 蛋
10、白质分子荧光探针 在生物体中，蛋白质是必不可少的生命活性物质。有关蛋白质的各类研究是目前生命科学、化学和医学科学中共同关注的课题。近年来在特定蛋白质的光学标记方面，尤其是分子小、量子效率高、荧光探针分子设计与应用方面的研究取得了较大进展。但仍存在着许多有待解决的问题，如小分子标记对于细胞内存在的各种复杂情形而言，其标记的特异性目前仍旧具有挑战性；尚未在真正意义上实现运用多种参数对生物活体内各类蛋白质进行实时观测、动态研究。可以预计今后相关研究将会侧重于以下几个方面：第一，合成新型分子荧光探针，提高灵敏度，增强光稳定性，降低合成成本，开发出更多针对生物活体内不同种类蛋白质分析检测的特异性荧光探针
11、。二，深入研究荧光探针与蛋白质的作用方式，对蛋白质进行定量分析和特异识别来探讨生命机理，加深对生命过程机理的理解。三，利用激光共聚 焦等荧光成像技术实现对一些生物过程运用多种方法、多种参数进行多层面实时观测、动态研究，开发新的、灵敏的、能进行活体追踪和检测的分析测试方法。四，蛋白质表达的变化或异常会造成疾病的发生，通过蛋白质标记物研究疾病机理，对疾病进行预警，防患于未然，实现对疾病的早期发现、早期治疗和早期诊断，同时开发针对各种疾病机理的高效药物。 七 总结 如今，荧光技术已经受到越来越多的关注。荧光分析技术由于它的高灵敏度、高选择性，使它在医学检验、卫生检验、药物分析、环境检测及食品分析等方面有广泛的应用。同时，荧光在生命科学中也发挥出巨大的作用在生物学、医学等学科的有力推动与渗透下，随着新型、性能优异的荧光探针的不断开发与应用，人类将能够实现对生命特质的结构与功能的探讨，进而解释生命的奥秘，极大地推动并促进生命科学、分析化学与医学的发展。 1.物理化学 傅献彩 沈文霞 姚天扬 侯文华 主编 高等教育出版社 2.CdTe纳米量子线荧光探针的制备、性质及分析应用研究 牛金叶 山东师范大学 3.DNA分子荧光探针 陈秀英 彭孝军 大连理工大学 4.蛋白质分子荧光探针研究及其应用新进展 陈蓁蓁 张宁 山东师范大学
