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1、蔬菜中天然色素的提取和分离化学与制药工程学院 综合与设计性化学实验 实验类型： 综合 实验题目： 菠菜中天然色素的提取和分离 蔬菜中天然色素的提取和分离 一、目的与要求 1.了解叶绿素的基本性质及提取方法。 2.掌握薄层层析法分离微量组分的操作技术。 二、基本原理 叶绿素是一种十分重要的植物色素。它的存在确保了植物能够进行光合作用。即在太阳光能的作用下，植物将所吸收的二氧化碳和水变成糖类并释放氧气的过程： 6CO2+6H2O- C6H12O6+6O2 绿色植物的叶片时进行光合作用的主体，而叶绿素是光合作用的重要细胞器官，在进行光合作用时，叶绿体的光合色素将光能转变成化学能，提供了植物生长所必需
2、的养分。 叶绿体色素包括叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等组分，其中叶绿素的吸光能力极强。叶绿素a和叶绿素b的化学式如下： 叶绿素a呈蓝绿色，叶绿素b呈黄绿色。它们的吸收光谱如图所示 从图中可以看出，叶绿素a、叶绿素b的强吸收带有两个，一个在波长为630-680nm的红光区，另一个在波长为400-460nm的蓝紫光区。 从叶绿素a和叶绿素b的化学式可以看出，叶绿素是叶绿酸的脂。叶绿酸是双脂酸，其2个羧基分别被甲醇和叶绿醇(C20H39OH)所醇化。 叶绿素a，叶绿素b的分子结构如下图所示： 叶绿素a 叶绿素b 图 1.1 叶绿素a和叶绿素b的化学结构式 可以看出，叶绿素分子含有4个吡咯环，
3、它们和4个次甲基连接成一个大环，称为卟啉。镁原子居于卟啉环的中央。另外有一只含碳原子的副环，在环上连接有一个羰基和羧基，羧基与甲醇结合生成酯。叶绿醇则和第吡咯环侧链上的丙酸生成酯。各种 叶绿素之间的差别在于和吡咯环相连接的侧链结构有所不同。叶绿素a和叶绿素b的区别， 在于第吡咯环上第三碳位上的取代基R的不同。叶绿素a的R为甲基，而叶绿素b的R则为一个羰基。 在第吡咯环上的叶绿醇侧链是相对高分子质量的碳氢化合物，这是叶绿素分子的亲脂部分，使其具有亲脂性；叶绿素分子的上端金属卟啉环中，镁原子偏向于带正电荷，而氮原子带负电荷，呈极性，因而具有亲水性。但叶绿素不溶于水，而溶于乙醇、丙酮、和石油醚等有机
4、溶剂。大多数植物体中叶绿素a的含量比叶绿素b的含量多23倍。 由于叶绿素卟啉环中的镁可被氢离子置换形成脱镁叶绿素，在脱镁叶绿素中引入其它金属离子则生成各种改性叶绿素。但只有离子半径与Mg2+半径相近的离子才易引入卟啉环的空腔，并形成足够稳定的络合物。 2.薄层层析法的基本原理 薄层层析是一种分离、鉴定微量组分的常用方法。这种方法把固定相吸附剂均匀地铺在一块玻璃板上形成薄层，在此薄层上进行层析。待分离的样品溶液点在薄层一端，试样中各组分就被吸附剂所吸附，但吸附剂对不同物质的吸附能力是不同的。将薄层板点有样品的一端浸入层析缸，在流动相展开剂的作用下展开。由于薄层吸附剂的毛细作用，展开剂将沿着薄板逐
5、渐上升。当溶剂流经试样时，样品中的各组分就溶解在展开剂中。在吸附剂的吸附力和展开剂的毛细上升力作用下，物质就在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附和解析平衡。吸附力强的物质相对移动得慢一些，而吸附力弱的物质相对移 动得快一些。经过一段时间的展开，样品中各物质就彼此分开，最后形成互相分离的斑点，称为薄层层析谱。 对于不同的样品，可以选择不同的吸附剂和展开剂；可以做吸附层析，也可以做分配层析或离子交换层析。层析谱不仅可做定性鉴定，也可以进行定量分析。每次点样所需的样品量仅几微升到几十微升，因此它是一种高效、快速的微量分析方法。 本实验进行菠菜中叶绿素的提取、分离和测定。 三、仪器和试剂 1. 仪器
6、 研钵。层析缸，分液漏斗 2.试剂 碳酸钙，丙酮，乙醚，石油醚，乙醇，硅胶G。 四、实验步骤 1 . 叶绿素的提取 新鲜菠菜叶依次用自来水和去离子水洗净，晾干；称取去梗的叶子4g，剪碎放于研钵中，加少量的碳酸钙和干净的石英砂及10mL去离子水，研成细浆。取5mL细浆于50mL大试管中，加入20mL丙酮，用玻璃棒搅拌35min，使色素溶解。放置片刻使残渣沉于试管底部，滤去残渣，得深绿色叶绿素丙酮溶液。 2. 制板 称取5g硅胶G粉于100mL烧杯中，加入11mL去离子水，搅拌均匀后倒在5cm*30cm玻璃板上，用玻璃棒均匀地摊开。然后，用手托住玻璃板一头，另一头放在桌面上轻轻振敲，尽量使薄层厚度
7、均匀，然后平放晾干。将晾干的薄层板放在110的烘箱中活化30min，取出放在干燥器中冷至室温。 3.展开 取5mL叶绿素丙酮提取液，于60mL分液漏斗中，加入3mL乙醚萃取，弃下层丙酮溶液，得叶绿素的乙醚提取液。在暗处距离薄板一端2cm处用毛细管 点样，将试液点成一条线，待第一次液点干后再点一次，共重复5次， 色素分离的展开剂采用乙醚石油醚丙酮正丙醇。将上述展开剂注入层析缸中，摇匀，然后将薄层板直立于缸中，展开剂浸没薄板下端的高度不宜超过0.5cm，薄板上的样品原点不得浸入展开剂中。将层析缸盖好，放在暗处展开3040cm，待展开剂的前沿离薄板顶部12cm时，取出薄板，并在前沿处做出标记，待展开
8、剂挥发后可见到几条色带。从上到下依次为胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b。叶黄素。记下个色带中心到原点的距离和溶剂前沿到原点的距离，计算叶绿素a和叶绿素b的Rf值：Rf=a/b=原点至斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离 在薄层层析中，常用Rf来表示各组分在层析谱中的位置，它与被分离物质的性质有关，在一定条件下为一常数，其值在01之间。被分离物质间的Rf值相差越大，则分离效果越好。 4.叶绿素a和叶绿素b的色带从玻璃板上刮下来并放在离心管中，加入5mL乙醚，振摇，离心后得澄清蓝绿色溶液。在仪器上测定其在360700nm波长范围的吸收曲线，并与图48-1进行比较。 五、问题与思考 1.从菠菜中提取叶绿
9、素时加入少量碳酸钙的作用是：防止失去Mg；中和植物细胞中的酸。 2.点样及画线时应十分小心，不要将薄层碰破。 3.测定吸收光谱时若样品量较少，可同时展开两块或三块薄板，将叶绿素斑点刮下来同时测定。 4.叶绿素对酸、碱和光很敏感，整个实验应在中性条件和暗处进行。各操作步骤应在尽可能短的时间内完成。 五、实验记录 8:10 用天平称取4.0g菠菜叶，放入研钵中剪碎放于研钵中，加少量的碳酸钙和干净的石英砂及10mL去离子水，研成细浆。取5mL细浆于50mL大试管中，加入20mL丙酮，用玻璃棒搅拌35min，使色素溶解。放置片刻使残渣沉于试管底部，滤去残渣，得深绿色叶绿素丙酮溶液。 8：55 取5mL
10、叶绿素丙酮提取液，于60mL分液漏斗中，加入3mL乙醚萃取，弃下层丙酮溶液，得叶绿素的乙醚提取液。 9：10 在暗处距离薄板一端2cm处用毛细管点样，将试液点成一条线，待第一次液点干后再点一次，共重复5次。 9：30 色素分离的展开剂采用乙醚石油醚丙酮正丙醇。将上述展开剂注入层析缸中，摇匀，然后将薄层板直立于缸中，展开剂浸没薄板下端的高度不宜超过0.5cm，薄板上的样品原点不得浸入展开剂中。将层析缸盖好，放在暗处展开3040cm，待展开剂的前沿离薄板顶部12cm时，取出薄板，并在前沿处做出标记，待展开剂挥发后可见到几条色带。从上到下依次为胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b。叶黄素。记下个色带中心到原
11、点的距离和溶剂前沿到原点的距离，计算叶绿素a和叶绿素b的Rf值：Rf=a/b=原点至斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离。 3. 10：20 测 量： b= 叶绿素a： a= Rf= 叶绿素b： a= Rf= 4. 10:50 制板： 称取5g硅胶G粉于100mL烧杯中，加入11mL去离子水，搅拌均匀后倒在5cm*30cm玻璃板上，用玻璃棒均匀地摊开。然后，用手托住玻璃板一头，另一头放在桌面上轻轻振敲，尽量使薄层厚度均匀，然后平放晾干。将晾干的薄层板放在110的烘箱中活化30min，取出放在干燥器中冷至室温。 5. 11：20 实验完毕，清洗仪器，整理实验台。 六、实验讨论与心得 1. 通过这次实验，我学会了蔬菜中叶绿素的提取和分离，也知道了叶绿素的种类及其光谱性质。 2 通过这次实验，使我对薄层分析有了进一步的了解，掌握了用途的操作技术。3. 在实验过程中本人认真，谨慎，坚持做好每一步，但由于在展开时其他同学把硅胶弄破，导致实验不是很理想，测量数据会偏离较大，望老师谅解！ 七、评语和成绩 成绩： 指导教师：
