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1、ALT,AST测定方法3.8.2.1小鼠肝、肾、心组织ALT含量测定 1实验原理 谷丙转氨酶作用于由丙氨酸及-酮戊二酸组成的基质，在一定的反应条件下，产生一定量的丙酮酸。在酶反应到规定时间时，加入2,4-二硝基苯肼，在当量浓度的酸性条件下，终止了酶反应。2,4-二硝基苯肼分别与反应产生的丙酮酸及剩余的基质-酮戊二酸形成各自对应的2,4-二硝基苯腙。在碱性条件下，虽然二种苯腙分别显出红棕色，但由于丙酮酸生成的颜色较深，以同等克分子计算，在480-530nm波长范围内其浓度约为-酮戊二酸生成的颜色的3倍，利用这一差别可以反映出丙酮酸的生成量。本实验设谷草转氨酶活力为：样品液与ALT基质液在37下反
2、应60min时每生成1mol丙酮酸所需的酶量为1个活力单位。 2试剂配制 0.1mol/L磷酸缓冲液 称取NaH2PO4.2H2O 2.96495g，Na2HPO4.12H2O 29.0142g，溶解于蒸馏水中，定容到1000mL。 20mol/L丙酮酸钠标准溶液 称取22mg丙酮酸钠，溶解于0.1mol/L磷酸缓冲液100mL中。现配现用。 ALT基质液 称取-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸1.78mg溶解于30mL 0.1mol/L磷酸缓冲液中，溶解后校正pH至7.4，再用pH7.4的磷酸缓冲液定容至100mL，置冰箱中保存备用。可加入氯仿数滴防腐。 0.02% 2，4二硝基苯肼溶液
3、称取20mg2，4二硝基苯肼先溶解于10 mL纯盐酸中，电炉加热助溶，待2，4二硝基苯肼全部溶解后，用蒸馏水稀释至100mL，过滤后盛于棕色中，置冰箱中保存备用。 1mol/L NaOH溶液： 称取4g NaOH溶解于蒸馏水后，定容到100mL。 0.4 mol/L NaOH溶液 称取16 g NaOH溶解于蒸馏水后，定容到1000mL。 3实验方法 样品的处理按 3.5 方法进行。 ALT标准曲线的制作 1 将测定所用试剂除氢氧化钠溶液外全部置于水浴箱内，预温37至然后使用取6支试管，按表4进行配制 表4 ALT标准曲线的配制 试管编号 试剂(mL) 20mol/L丙酮酸钠标准溶液 ALT基
4、质液 0.1mol/L磷酸缓冲液 0 1 2 3 4 5 0.00 0.50 0.10 0.05 0.45 0.10 0.10 0.40 0.10 0.15 0.35 0.10 0.20 0.30 0.10 0.25 0.25 0.10 混匀，将各管置于37水浴中保温60min 2,4-二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，将各管置于37水浴中保温20min 0.4 mol/L NaOH溶液 5 5 5 5 5 5 混匀，将各管置于37水浴中保温10min 2冷却后以0为对照用分光光度计比色测定吸光值OD520nm。 3以丙酮酸含量为纵坐标，吸光值OD520nm为横
5、坐标绘制标准曲线(见图3)。 0.60.50.40.30.20.1000.10.2吸光度图3 0.30.4ALT标准曲线见图3，建立回归方程为： y =1.4149x (线性相关系数：R0.9965) 其中：x吸光度； y丙酮酸含量(mol/L) (3) 小鼠肝、肾、心组织ALT含量测定 1 将测定所用试剂除氢氧化钠溶液外全部置于水浴箱内，预温至然后使用取2支试管，按表5进行配制 表5 ALT含量测定 试 剂 mL 管 样品 号 0 0.10 - 1 0.10 0.50 ALT基质液 混匀，将各管置于37水浴中保温60min ALT基质液 2，4二硝基苯肼 0.50 0.5 - 0.5 混匀，
6、将各管置于37水浴中保温20min 0.4 mol/L NaOH溶液 5 5 混匀，将各管置于37水浴中保温10min 2冷却后以0为对照用分光光度计比色测定吸光值OD520nm。 3在标准曲线中读出样品丙酮酸的生成量(见图3) 。 3.8.2.2小鼠肝、肾、心组织谷草转氨酶含量测定 1实验原理 AST作用于门冬氨酸和-酮戊二酸组成的基质，在一定的反应条件下，产生一定量的草酰乙酸，草酰乙酸在反应过程中又自行脱羧成为丙酮酸。在酶反应到规定时间时，加入2,4-二硝基苯肼，在当量浓度的酸性条件下，终止了酶反应。2,4-二硝基苯肼分别与反应产生的丙酮酸及剩余的基质-酮戊二酸形成各自对应的2,4-二硝基
7、苯腙。在碱性条件下，虽然二种苯腙分别显出红棕色，但由于丙酮酸生成的颜色较深，以同等克分子计算，在480-530nm波长范围内其浓度约为-酮戊二酸生成的颜色的3倍，利用这一差别可以反映出丙酮酸的生成量。本实验设谷草转氨酶活力为：样品液与AST基质液在37下反应60min时产生的草酰乙酸自行脱羧成为1mol丙酮酸所需的酶量为1个活力单位。 2试剂配制 (1) 0.1mol/L磷酸缓冲液 称取NaH2PO4.2H2O 2.96495g，Na2HPO4.12H2O 29.0142g，溶解于蒸馏水中，定容到1000mL。 (2) 20mol/L丙酮酸钠标准溶液 称取22mg丙酮酸钠，溶解于0.1mol/
8、L磷酸缓冲液100mL中。现配现用。 (3) AST基质液 称取-酮戊二酸29.2mg，DL-门冬氨酸2.66 g，置于亦小烧杯中，加入1N氢氧化钠溶解，丙校正pH至7.4，再用pH7.4的磷酸缓冲液定容至100mL，置冰箱中保存备用。 (4) 0.02% 2，4二硝基苯肼溶液 称取20mg2，4二硝基苯肼先溶解于10 mL纯盐酸中，电炉加热助溶，待2，4二硝基苯肼全部溶解后，用蒸馏水稀释至100mL，过滤后盛于棕色中，置冰箱中保存备用。 (5) 1mol/L NaOH溶液： 称取4g NaOH溶解于蒸馏水后，定容到100mL。 (6) 0.4 mol/L NaOH溶液 称取16 g NaOH
9、溶解于蒸馏水后，定容到1000mL。 3实验方法 (1) 样品的处理按 3.5 方法进行。 (2) AST标准曲线的制作 1 将测定所用试剂除氢氧化钠溶液外全部置于水浴箱内，预温至然后使用取6支试管，按表6进行配制 表6AST标准曲线的配制 试管编号 试剂(mL) 20mol/L丙酮酸钠标准溶液 AST基质液 0.1mol/L磷酸缓冲液 0 1 2 3 4 5 0.00 0.50 0.10 0.05 0.45 0.10 0.10 0.40 0.10 0.15 0.35 0.10 0.20 0.30 0.10 0.25 0.25 0.10 混匀，将各管置于37水浴中保温60min 2,4-二硝基
10、苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，将各管置于37水浴中保温20min 0.4 mol/L NaOH溶液 5 5 5 5 5 5 混匀，将各管置于37水浴中保温10min 2冷却后以0管为对照用分光光度计比色测定吸光值OD520nm。 3以丙酮酸含量为纵坐标，吸光值OD520nm为横坐标绘制标准曲线(见图4)。 0.60.50.40.30.20.1000.10.2吸光度图4 AST标准曲线见图4，建立回归方程为： y =1.3294x (线性相关系数：R0.9992)其中：x吸光度； y丙酮酸含量(mol/L) (3) 样品AST含量测定 测定方法同ALT含量测定。 0.30.4
