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1、HE染色实验报告华中农业大学动物科技动物医学院 he染色与免疫组织化学染色实验报告 1 实验目的及意义 1.1了解石蜡切片的制作过程 1.2 掌握he染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法 1.3 熟悉he染色与免疫组织化学染色后的读片知识 2 实验方法及步骤 2.1 石蜡切片制作及he染色步骤 2.1.1取材与固定： 从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过05厘米)投入预先配好的固定液中(10福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。 2.1.2脱水透明： 一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再
2、将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。 2.1.3浸蜡包埋： 将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。 2.1.4切片前的准备工作： 先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。 2.1.5切片与贴片： 将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切
3、片厚度为6微米，切成薄片。切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45恒温箱中烘干。 2.1.6 脱蜡至水 华中农业大学动物科技动物医学院 二甲苯20分钟，二甲苯20分钟，无水乙醇3分钟，95酒精3分钟，80酒精3分钟，70酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.1.7染色： 苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95酒精3分钟，1伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.1.8脱水和透明： 95酒精2分钟，无水酒精2分钟，无水酒精2分钟，二甲苯5
4、分钟，二甲苯5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.1.9封固： 将已透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固，放入37烘箱。 2.2 sabc 染色步骤 2.2.1脱蜡至水： 二甲苯20分钟，二甲苯15分钟，100酒精2分钟，95酒精2分钟，80酒精2分钟，70酒精2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.2.2流水冲洗5分钟 2.2.3用蒸馏水配置新鲜的3%双氧水，室温封闭15分钟，注意避光。 2.2.4蒸馏水洗5分钟，重复2次。 2.2.5热抗原修复，将切片浸入0.01m枸盐酸盐缓冲液中，置微波炉内高火5分钟，低火20分钟，完后自然冷却。 2.2.6取出切片放
5、入染色缸中pbs洗5分钟，重复3次。 2.2.7取出切片放入湿盒中，滴加5%bsa封闭液，室温20分钟。 2.2.8甩去多余液体，滴加一抗注:阴性对照滴加pbs,放入4冰箱过夜。 2.2.9放入染色缸中pbs洗5分钟，重复3次。 2.2.10取出放入湿盒中滴加二抗，室温30分钟。 2.2.11取出置染色缸中pbs洗5分钟，重复3次。放回湿盒中加sabc，室温30分钟。 华中农业大学动物科技动物医学院 2.2.12取出置染色缸中pbs洗5分钟，重复3次。 2.2.13 dab显色，取一试管加1ml单蒸水，b、c、a试剂按顺序各一滴加入试管中混匀，滴加于切片上，观察是否终止显色。 2.2.14终止
6、显色用单蒸水洗5分钟，重复2次。 2.2.15苏木素衬染1分钟，流水冲洗5分钟。 2.2.16脱水透明，70酒精3分钟，80酒精2分钟，90酒精2分钟，95酒精2分钟，95酒精2分钟，100酒精2分钟，100酒精2分钟，100酒精2分钟二甲苯8分钟，二甲苯5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。 2.2.17中性树胶封片，放入37烘箱。 3 实验结果 3.1 he 染色结果 华中农业大学动物科技动物医学院 a ib b ib ib： 狂犬病毒包涵体小体） 图1 狂犬病毒感染后脑组织病变 he染色 a: 小脑浦肯野细胞内包涵体x400; b: 脑神经元内多处包涵体x400 狂犬病的病理
7、变化在显微镜下主要表现为神经元退变,淋巴细胞和单核细胞浸润，胶质细胞增殖以及特征包涵体形成。狂犬病毒包涵体又称为内基体，直径 华中农业大学动物科技动物医学院 约310nm，边缘整齐，内有12个状似细胞核的小点,主要出现在大脑海马区及小脑，其他部位也可见，在病变神经元胞浆内成圆形或卵圆形，苏木素一伊红染色脑组织切片中呈嗜酸性反应，病变神经元可含包涵体。大脑海马区神经元和小脑浦肯野细胞胞浆内检出狂犬病病毒包涵体，伴脑组织淤血、水肿。神经元变性 a b c d cp： 豆状囊尾蚴虫卵的壳 图2 肝脏与肾脏的病变 he染色 a: 豆状囊尾蚴在肝脏形成包囊x200; b: 脑神经元内多处包涵体x400
8、c：肾小管结构模糊，破坏x200; d: 肾小管上皮从基底膜脱落x400篇二：he染色实验技术服务说明 he染色实验技术服务说明 -上海高校科研技术实验室 he服务简介 苏木精 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，简称he染色法 ，石蜡切片技术里常用的染色法之一 。苏木精染液为碱性 ，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料 ，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。he染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法 客户提供样品： 1，组织样本材料要新鲜，组织离体后应立即投入固定液中。 2，细胞样本离心
9、后弃去上清液加入3%戊二醛固定液。 实验流程： (1)二甲苯 15min (2) 二甲苯 15 min 二甲苯：无水乙醇=1:1 2min (4)100%乙醇 5min (5)100%乙醇 5 min (6)80%乙醇 5min (7)蒸馏水 5 min (8)苏木精液染色 5 min (9) 流水稍洗去苏木精液 1-3 s (10) 1%盐酸乙醇 1-3 s (11) 稍水洗 10-30 s (12)蒸馏水过洗 1-2 s (13) 0.5%伊红液染色 1-3 min (14) 蒸馏水稍洗 1-2 s (15) 80%乙醇稍洗 1-2 s (16) 95%乙醇 2-3 s (17) 95%乙
10、醇 3-5 s (18) 无水乙醇 5-10 min (19) 石炭酸二甲苯 5-10 min (20) 二甲苯 2 min (21) 二甲苯 2 min (22) 二甲苯 2 min (23) 中性树胶封固 检测周期 二天左右提供结果 预约及收费 1.预约时间：早上9：0019：00 3.收费标准：30元/样本 提供结果 1.染色后的切片； 2.每张切片提供一张照片； 3.完整的实验报告，包括具体实验方法、步骤、所用试剂、仪器等，将以电子或书面形式提交给您。 篇三：实验技术he染色 小鼠胚胎切片原位杂交 主要试剂及配制方法： a) 原位杂交用10pbs储存液：向1l烧杯中依次加入29.22
11、g nacl ，13.86 g na2hpo412h2o 和1.763 g nah2po42h2o，然后加入400ml ddh2o充分搅拌溶解，用固体naoh将ph调节至7.4，然后加入ddh2o定容至0.5 l，最后各组分终浓度为nacl=1.3mol/l，na2hpo4=70mmol/l，nah2po4=30mmol/l，高压灭菌后室温保存备用； b) 1pbs工作液：将10pbs储存液用灭菌水稀释10倍即可； c) 10甘氨酸溶液：称取甘氨酸10g溶于ddh2o或depc水中，最后补足ddh2o定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20储存。使用时用pbs将10甘氨酸储备液稀
12、释为工作液，然后加水定容至1l，最后高压灭菌，室温保存备用； f) 1m mgcl2 ：在800ml水中溶解203.4g mgcl26h2o，用水定容至1l，高压灭菌， 室温保存备用； g) 20%用ddh2o稀释10倍即可使用； i) 2 g/ml proteinase k/pbs：使用时配制，将proteinase k (20mg/ml，-20 ?c冷冻保 存）用pbs稀释10000倍使用； j) 乙酰化试剂：如配制40 ml溶液，需加入530 ?l三乙醇胺，100 ?l冰乙酸，70 ?l 浓hcl，ddh2o定容至40 ml； k) nt buffer：各种成分终浓度为0.1 m tri
13、s-hcl ( ph7.5 )，0.15 m nacl。如配制1 l 该溶液，需加入100 ml 1m tris-hcl ( ph 7.5 )，30 ml 5 m nacl，ddh2o定容至1 l； l) ntm buffer：各种成分终浓度为0.1 m tris-hcl ( ph9.5 )，0.1 m nacl，0.05 m mgcl2。如配制40 ml该溶液，需加入4 ml 1 m tris-hcl ( ph 9.5 )，0.8 ml 5 m nacl，2 ml 1 m mgcl2，ddh2o定容至40 ml； m) 20ssc：如配制250 mlnacl 43.8 g，二水合柠檬酸钠 2
14、2.1 g，然后加入ddh2o至200 ml，加入hcl或naoh调节ph至7.0，最后定容至250ml，高压灭菌备用； n) 50denhardts：10g聚蔗糖，10g牛血清白蛋白用水定容至1l，过滤后-20 ?c保存备用； o) 杂交液：即5ssc hybridization buffer，各成分终浓度及用量如下表： 注：配制好的预杂交液在-20?c保存备用； p) 马来酸缓冲液：含100mm马来酸和150mm nacl，ph为7.5；如配制500ml该缓冲液：向400ml去离子水中加入4.38g nacl和5.81g马来酸，然后加入适量固体naoh调节ph至7.5，定容为500ml，灭
15、菌后-20保存备用； q) 10封闭剂 r) 抗体溶液：抗体原液用1封闭剂稀释5000倍后使用，可回收存于4?c再使用； s) nbt溶液：把0.75g氯化氮蓝四唑溶解于10ml70%的二甲基甲酰胺中,保存于4。 t) bcip溶液：把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐溶解于10ml的二甲 基甲酰胺中，保存于4 u) 染色液：8-12l nbt/bcip混合溶液加到1ml ntm 溶液中； v) 10te：tris-hcl(ph7.5)终浓度为0.1m，edta终浓度为0.01m，配制1l该溶液配方如下：100ml 1m tris-hcl(ph7.5)，加20ml 0.5m edta
16、主要实验步骤： (1) 切片脱蜡-杂交 a) 将切片按一下顺序进行脱蜡并水饱和： 二甲苯 5分钟 通风橱操作 100%乙醇/pbs 5分钟 镜检是否组织完整 75%乙醇/pbs 5分钟 50%乙醇/pbs 5分钟 1pbs 5分钟 注意：防止脱片，如果组织有脱落的趋势，在每步操作中轻拿轻放，并且尽量水平放置片子。 b) 蛋白酶k处理：2 g/ml proteinase k/pbs，室温反应5分钟左右；在杂交盒中放平操作，可将200300 l蛋白酶k滴加于切片上形成液滴并刚好覆盖胚胎；蛋白酶k的作用是在胚胎切片上消化打孔； c) 如果切片上在胚胎的心脏附近有红色的血迹，可用h2o2室温漂白35分
17、钟； d) 用甘氨酸处理10分钟，以终止蛋白酶k的消化和h2o2的漂白；应先配制20mg/ml的甘氨酸保存于4c冰箱，使用时用pbs稀释10倍； e) 切片用pbs漂洗5分钟两次后，用三乙醇胺乙酰化处理15分钟；0.1m三乙醇胺的配方是：530 l三乙醇胺，70 l 37% hcl，100 l冰醋酸，灭菌水补齐至40ml； f) pbs漂洗，室温，5分钟； g) 预杂交：将切片平放至密封小盒内，滴加预杂交液，使胚胎被完全覆盖；室温静置5分钟后，65 ?c放置1小时。可在盒底铺一层滤纸后加一些5ssc，以保持湿润；注意保持切片水平，防止杂交液侧流； h) 杂交：去掉预杂交液，加上含有300500 ng/ml的探针的杂交液，盖上一层石蜡膜，并注意排出气泡；将小盒密封好，放入65?c恒温箱内，静置过夜； (2) 抗体反应 a) 揭掉切片上的石蜡膜，注意揭膜的时候要用镊子提一个角，后卷变压边揭。如果切片上液体已蒸发，可将切片放置5ssc中浸泡片刻再揭膜，泡下来也勉强可以； b) 洗净： 0.2ssc 65?c 12小时洗净； 0.2ssc 室温 10分钟； nt buffer 室温 5分钟； c) 封闭： 将切片放入小盒内，加上1封
