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1、HisGFP蛋白的纯化步骤以His-GFP为例简述His-tag蛋白的纯化 His-tag是重组蛋白中最常用的融合标签之一。使用镍柱纯化His-tag融合蛋白的原理为：组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。实验中一般选用6个组氨酸的标签。His6标签有许多优点： 由于只有6个氨基酸，分子量很小，对蛋白结构和活性的影响较小，一般不需要酶切去除； 可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力； His6标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。 His6标签也有一些不足，
2、如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落，混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。 本实验将以His-GFP为例，阐述His-tag蛋白的纯化过程。 1. E. coli重组菌体破碎 表达完成的E. coli重组菌体，经超声或细胞破碎仪进行破碎。当需要破碎的细胞沉淀较少时，通常在Eppendorf管中，用超声法完成细胞裂解。而当细胞沉淀较多时，可选用细胞破碎仪进行破碎。本实验采用细胞破碎仪法。 细胞破碎仪法： 称量细胞沉淀的湿重，加入细胞湿重10倍体积的裂解缓冲液。如，1 g细胞沉淀加入约10
3、 ml的裂解缓冲液，使得细胞在溶液中的终浓度为10-15%，在此范围内细胞破碎的效果较好。过浓或过稀的细胞浓度均不利于破碎效率。裂解缓冲液的组成如下： Lysis buffer： 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 100 mM NaCl 10 mM imidazole 0.1% Triton X-100 1 protease inhibitor 将细胞沉淀在裂解buffer中充分搅拌至没有结块后，进行高压破碎。 细胞破碎仪的使用方法：首先加水至规定线后，开压缩机，将冷却水制冷至4oC，方可使用。本过程可能要要持续20 min左右。 待水冷却至4oC后，开始破碎。为保证破碎效果，一般
4、重复三次。破碎完成后，一定要卸压、放水、清洗样品槽。 2. 离心 细胞裂解液15000 rpm、4C离心45 min，去除细胞碎片。离心完成后，得到的上清即细胞裂解液上清用来做进一步的纯化。对于GFP来说，由于折叠好的GFP本身具有颜色，因此可以通过颜色来判断在细胞裂解液上清、沉淀中是否具有GFP。 在本实验中， ml的培养物最终得到了 g的细胞沉淀，加入 ml的裂解缓冲液，最终得到 ml的细胞裂解液上清。 3. His-GFP蛋白的纯化 Ni sepharose 6 FF凝胶的预处理：在直径2.5 cm的层析柱中装入适量的凝胶。本实验中选用2 ml凝胶。待液体流完后，分别用5 CV H2O和
5、5 CV平衡缓冲液处理凝胶。平衡好的凝胶以待使用。 平衡缓冲液的配制： 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 100 mM NaCl 10 mM imidazole 吸附：将平衡好的凝胶加入到细胞裂解液上清中。将此混合物在4oC层析柜的混匀器上混匀30 min。 装柱：将层析柱的下端打开，让未结合的蛋白随液体流出，收集流穿。如果GFP完全吸附到柱子上，那么流穿中应该没有颜色，而柱子上应该有较重的黄绿色。流穿中的黄绿色越重，说明蛋白的吸附不理想。这种情况下，需要考虑调整平衡缓冲液的pH、NaCl的浓度、咪唑的浓度；以及吸附时间、细胞裂解液上清：凝胶的体积比等。 洗脱非特异吸附的蛋白：用1
6、0 ml的10 mM imidazole洗脱非特异吸附的蛋白，自然流速洗脱，每1 ml一收集。 目的蛋白的洗脱：分别用10 ml的50 mM、250 mM、500 mM的imidazole洗脱目的蛋白，自然流速洗脱，每1 ml一收集。 洗脱级分的检测：10% SDS-PAGE检测各洗脱级分。 o镍柱的清洗：如果柱子上仍有残留的蛋白或者是脂类等物质未被洗脱下来，可以用2 M NaCl或0.5 M NaOH在自然流速下洗2 cv，然后用5 cv H2O继而5 cv平衡缓冲液冲洗。 镍柱的再生：如果镍柱已使用超过5次，或明显可看到镍柱颜色变浅，或纯化其它蛋白担心引起交叉污染，可对镍柱进行再生，程序如
7、下： 1） 5 cv binding buffer 2） 5 cv EDTA 3） 5 cv H2O 4） 5 cv binding buffer 5） 2 cv 0.1 M NiSO4 6） 5 cv H2O 7） 5 cv binding buffer 此时，柱子再生完毕，可继续使用。 蛋白纯化中应注意的事项： 1. 缓冲液的选择：应根据目标蛋白的pI值和pH稳定性等条件来选择。例如，GFP的等电点是5.67，那么我们估测GFP在pH7.5附近应该为稳定的，因此我们首先尝试pH7.4的Tris-HCl缓冲液。如果实验结果表明该pH条件不稳定，那么我们再考虑换用其它缓冲体系。注意选择缓冲液时
8、应避开蛋白质的等电点，因为蛋白质在其等电点时溶解度最小，容易沉淀，不利于蛋白质的稳定。此外，在进行融合表达时，计算目标蛋白的pI时，应考虑到融合标签的影响。 2. 平衡缓冲液中NaCl及imidazole浓度的选择：在平衡缓冲液中加入NaCl及imidazole均是为了尽可能减少非特异吸附。具体浓度应根据Ni柱说明书及具体蛋白的特性进行调节。 3. 吸附时间的选择：对于镍柱而言，一般30 min的吸附时间即已足够。但是对于一些吸附较差的蛋白，可酌情延长吸附时间。但需要注意的是，吸附时间过长，可能会增加非特异吸附。因此需要在目的蛋白的吸附和非特异吸附之间做出平衡。 4. 细胞裂解液上清：凝胶的体
9、积比：可根据Ni柱说明书中的每ml凝胶的蛋白载量进行适量调节。凝胶过少，则目标蛋白不能完全吸附，从流穿中流出；凝胶过多，则导致洗脱体积变大，以及不必要的非特异吸附。 5. 目标蛋白的洗脱：用高浓度的imidazole进行目标蛋白的洗脱时，如果对该蛋白没有纯化经验，可采用线性imidazole梯度进行洗脱，如从10 mM 500 mM imidazole进行洗脱，找出目标蛋白被洗脱出来的imidazole浓度区间。如采用分步梯度洗脱，应保证每个梯度均应洗2倍柱体积以上。 6. 洗脱蛋白的检测：用SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化情况。具体使用多大浓度的分离胶，应根据目标蛋白的分子量确定；上样量的多少，可粗略根据洗脱级分的280nm的吸光度进行估测，一般来说，电泳每个泳道上样1-10 ug比较理想，过少则条带不清晰，过多则容易跑成一团，不容易分辨各条带。 7. 蛋白的储存：纯化得到的蛋白可透析或超滤后除去咪唑，加入5%的甘油，液氮速冻后-80oC保存。需要注意的是，蛋白质的反复冻融将对其活性造成不可逆的损失，因此应尽量避免，可将蛋白溶液分装成若干小份，每次取用一份。
