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1、PCR产物的TA克隆PCR产物的TA克隆 (DNA的胶回收和连接) 1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。 2.利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。 商品化的T载体有很多。本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。这个载体以pUC19
2、载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoR酶切后在两侧的3端添上“T”制备而成。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。 试剂 1.pMDTM18-T Simple Vector Kit。 2.TAE电泳缓冲液 3.琼脂糖 4.6电泳加样缓冲液：0.25 溴粉蓝，40(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4。 5.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。 1 / 6 6.70%乙醇 7.胶回收试剂盒 器材 水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水
3、浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。 胶回收试剂盒回收PCR产物 1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。 2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。近似地确定其体积。加入等体积的Binding Buffer，于55-65水浴中温浴7min或至凝胶完全融化，每2-3 min振荡混合物。 3.取一个干净的HiBind DNA Mini柱子装在一个干凈的2ml收集管内。 4.将第三步获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中。室温下10,000 x g离心1分钟。弃收集管中的滤液，将柱子套回2
4、ml收集管内收集管。 5.如果DNA/凝胶熔液的体积超过700ul，一次只能转移700ul至柱子中，余下的可继续重复第5步至所有的溶液都经过柱子。每一个Hibind DNA回收纯化柱都有一个极限为25g DNA的吸附能力。如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱子中。 2 / 6 6.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移300l Binding Buffer至柱子中，室温下， 10,000 x g下离心1min。 7.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移700l SPW Wash buffer至柱子中。室温下10,000xg离心1min。 8.重复用7
5、00l SPW Wash buffer洗涤柱子。室温下10,000xg离心1min。 9.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,13,000 x g离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。 10.把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入1530l的Elution Buffer(或TE缓冲液)到柱基质上，室温放置1min, 13,000xg离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出70-80%的结合DNA。 如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA洗脱出来，不过那样的浓度就会较低。 连接反应 1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 l。 pMDTM18-T Sim
6、ple Vector 1 l Insert DNA 0.1 pmol0.3 pmol dH2O up to 5 l 2）加入5 l的 Solution I。 3 / 6 3）16反应30分钟。 4）全量加入至100 l 感受态细胞中，冰中放置30分钟。 5）42加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 6）加入890 l LB培养基，37振荡培养60分钟。 7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，鉴定载体中插入片段的长度大小。 1.使用新鲜的电泳缓冲液TAE Buffer。不要重复使用，其PH的升高会减少产量。 2.不论
7、采取何种方法回收DNA，在回收过程中，要尽量减少洗脱体积，以便提高收得率和浓度，以方便后续操作。 3.从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm)，以减少紫外光对DNA的切割。DNA曝露在紫外灯下不能超过30秒。 4.连接反应时间是与温度密切相关，因为反应速度随温度的提高而加快。通常可采用16连接4小时为宜，如是平端连接需要适当延长反应时间以提高连接效率；在选择反应的温度与时间关系时，也要考虑在反应系统中其他因素的影响。 5.连接反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染，为防止酶活性降低，取酶时应在冰上操作且动作迅速。7. 6.连接反应应在25以下进
8、行，温度升高较难形成环状DNA，影响连接效率。长片段PCR产物进行连接时，连接反应时间应延长至数小时。 4 / 6 7.进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为1:210。根据实验情况选择合适的摩尔数比。 8.用高效的感受态细胞，这样才可能得到比较理想的阳性克隆。 9.试剂盒配有Control DNA。通过对照实验判断试剂盒的保存效果。 第一天下午：配制6电泳加样缓冲液、TAE等缓冲液，将各种耗材灭菌。 第二天上午：制备琼脂糖凝，电泳检测，切胶回收DNA片段 第二天下午：大肠杆菌制备感受态细胞；DNA与T载体连接转化大肠杆菌。 第三天上午：观察转化结果，计算重组率。 1PCR产物的T-vector克隆方法，应注意哪些操作环节？ 2和其他组结果比较，对本组实验结果进行分析。 3对于用高保真Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，如何进行克隆？ 5 / 6 附录1： 6 / 6
