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1、shRNA原理及设计 shRNA原理及设计 RNAi概述：RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强
2、有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。 RNAi基本原理示意图： RNAi类别： 1、siRNA合成：原理：在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA。 化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。 2、microRNA干扰载体构建：原理：载体采用Pol II启动子表达人
3、工设计的微小RNA (miRNA), 后者从长的转录本被加工，进而导致特异性的mRNA的降解。 3、shRNA干扰载体构建：短发卡RNA (shRNA) 是可以克隆到表达载体并表达短的干扰RNA (siRNA, 19-21个核苷酸的RNA 双链)的DNA分子。我们可根据靶标设计短发卡RNA (shRNA)序列并将其克隆到特定载体上。 4、慢病毒RNAi：原理：慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRN
4、A相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirusshRNA/miRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 5、腺病毒RNAi：原理：腺病毒是一种没有包膜的线状双链DNA，它能感染分裂细胞和非分裂细胞，在核内以神经元细胞的形式复制，存在多种AV血清型。到目前为止，构建的绝大多数载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方法取代E1或E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在表达高水平E1和E3基因的细胞中复制，因此适合应用于治
5、疗的高效控制系统。腺病毒载体能够高效传递和表达基因的能力，由于具有宿主范围广，对人致病性低；在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；能有效进行增殖，滴度高；与人类基因同源；不整合到染色体中，无插入致突变性。对于难转染的细胞，如原代或非分裂细胞，采用病毒递送miRNA/shRNA的方式是非常有效的选择。 几个概念的区分： shRNAs (RNA-Short hairpin RNAs)：即短发夹RNA，是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，可通过RNA干扰来抑制基因的表达。Thomas Rosenquist和Greg Hannon小组联合研究了在哺乳动物种系细胞中shRNAs的转移导致基因长时
6、间稳定沉默的机制。 microRNA是由内源性发夹结构转录产物衍生而来的一种长为19 nt25 nt的单链RNA。在每种高等动物中，存在200种以上的miRNA，是最大的基因家族之一，约占基因组的1%。 siRNA：(short/small interfering RNAs)：即小干扰RNA，是一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径 miRNA，siRNA，dsRNA和shRNA都是RNA干扰技术中用到的小分子RNA，其不同之处在miRNA 是单链RNA，其余均为双链RNA；siRNA和dsRNA相似；shRNA需通过载体导
7、入细胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。 miRNA与shRNA图示： shRNA的设计： 1.克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环序列分隔的，组成发夹结构，由pol启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶的转录终止子。 2.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。 3.Stratagene发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。 4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。 5.ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。 6.ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环，5TCAAGAG3序列最为有效。 7.5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录。 8.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。这可能导致shRNA转录的提前终止。
