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1、SSR引物的筛选步骤SSR引物的筛选步骤 利用琼脂糖凝胶电泳对引物可扩增性进行筛选 通过反复摸索Tuber indicum的PCR反应体系和扩增条件，确定以下程序进行扩增。 25l反应体系：30 ng DNA 样品，2.0 mM MgCl2，0.2 mM dNTP，0.1 M引物，1.0U Taq DNA 聚合酶，1 PCR缓冲溶液。 扩增条件：94预变性2.5min，随后9430s，456030s，7230s，循环3040次，最后在72延伸20 min。 利用以上扩增产条件，选取三个居群的三个体，对引物的可扩增性进行筛选，并经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。 利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对引物的多
2、态性进行筛选 试剂配制： 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶配制：15ml的去离子水H2O，5ml 的5TBE，5ml 的40%聚丙烯酰胺溶液，180ul的10%过硫酸铵，16 ul的TEMED。 5TBE的配制：54g的Tris base，27.5g的硼酸，20ml0.5 mol/L的EDTA，最后定容至1L。 40%聚丙烯酰胺的配制：38.5g丙烯酰胺，1.5g甲叉双丙烯酰胺，加100ml去离子水搅拌溶解，棕色瓶4保存。 10%过硫酸铵的配制：2gAPS加20ml去离子水后搅拌溶解，于4保存，可保存2周，超过期限会失去催化作用。 实验步骤：顺序安装聚丙烯酰胺凝胶电泳仪各部件，灌胶并凝聚2小时。在电压105V，电流43mA条件下电泳3.5个小时，取下凝胶并进行以下步骤。 固定10分钟，后水洗1次。 银染3-10分钟，后水洗1次。 脱色15-60秒，后水洗2次。 显影10分钟。 再对筛选出的多态性引物用软件进行评价。 我用的是GENEPOP V.3.4 (http:/genepop.curtin.edu.au/)在线软件对微卫星位点水平、居群水平以及全局水平是否偏离哈迪温伯格平衡进行检测。 利用FSTAT V.2.9.3软件检测连锁不平衡存在与否。剔除存在连锁不平衡的引物对的其中之一，最终挑出7-10对扩增率高且稳定的引物用于后续试验。
