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1、T载体与目的基因连接一. 重组质粒的构建 T质粒载体 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。 DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3
2、 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5磷酸基和3羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。 连接反应的温度在37时有利于连接酶的活
3、性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16，连接12-16h，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 二. 感受态制备原理 细菌在0C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的感受态。 三. -半乳糖甘酶显色反应选择法 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码半乳糖核苷酶。半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。 现在一些特定的质粒，常带有半乳糖核苷酶的调控序列和半乳糖核苷酶N端146个氨基酸的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆
4、位点,它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有半乳糖核苷酶C端部分序列，的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成半乳糖核苷酶N端，这样就与宿主细胞合成的半乳糖核苷酶C端部分序列互补，形成完整的半乳糖核苷酶活性蛋白。 而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能表达，从而不能合成半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过互补合成半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，
5、出现蓝色菌斑。 实验准备：清洗，5个100ml锥形瓶，6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒 。准备100ml超纯水。溶液:LB300ml(液体50ml+50ml，固体100ml)，0.1mol/L CaCl2 10ml， 100mg/mlAmp 1 ml，20mg/mlX-gal 1 ml， 200mg/ml IPTG 1 ml。大肠杆菌菌液1ml 。 感受态细胞 4管 目的基因 4 x 4uL T载体 4x1uL 连接产物 4 x 5 = 20ul 做4份 T4连接酶 4x0.5uL 10x冲液 4x1uL 灭菌：5个100ml锥形瓶，6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒，10ml超
6、纯水，LB培养基，1.5mlEP管，大小枪头，过滤用具2副，0.1mol/L CaCl2 实际配置 20mg/ml X-gal X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20。X-gal溶液无须过滤除菌。 溶于DMSO，溶解度可达20mg/ml。也溶于DMF 溶于DMSO，溶解度可达20mg/ml。也溶于DMF 200mg/ml IPTG 在0.8ml蒸馏水中溶解0.2g IPTG后，用蒸馏水定容至1ml，用0.22m滤器过滤除菌，
7、贮存于-20。 LB培养基： 配制每升培养基,应该在950 ml去离子水中加入:胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.3.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min. 0.1mol/LCaCl2：取0.11098g氯化钙固体定容至10ml Amp：溶解0.1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至1ml，用0.22m滤膜过滤除菌. 实验过程 .目的基因片段与载体连接 器材 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。 试剂 T 载体，T4 DNA
8、 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water 。 操作步骤 PCR产物与T载体直接连接： 事先将干式恒温仪温度设定在1416C。 取4个灭菌的200ul微量离心管，加入： 4ml 目的基因 ；1ml T载体 ；0.5ml T4 DNA连接酶；1ml 连接酶缓冲液10 x buffer ；3.5 ml dd Water ，总量10ml 体系。 述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14C干式恒温仪中保温过夜。 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4C冰箱备用。 . 大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化 仪器：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，
9、台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器 试剂： E. coli菌种，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌dd Water ，LB培养基，LB培养基，无菌dd water，IPTG，X-gal。 步骤 在超净工作台中，将1ml大肠杆菌菌液加入100ml LB液态培养基，37摇床培养过夜。 取0.5ml上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37下250r/min摇床培养23h，测定OD590为0.350.4左右。 将1ml菌液加入到4支1.5mL预冷
10、无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4，5000rpm离心5min。 将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。 4，5000rpm离心5min，弃上清液后，用100L 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置2h，可以直接用作转化实验，或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏。 事先将恒温水浴的温度调到42。 从-70 超低温冰柜中取出一管感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴510min。 加入5L连接好的质粒混合液，轻轻震荡后放置冰上20min。 轻轻摇匀后插入42水浴中90
11、s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min。 在超净工作台中向上述各管中分别加入300L LB培养基轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37震荡1h。 在超净工作台中取上述转化混合液200L，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，再在平板上滴加40L 20mg/ml X-gal，7L 200mg/ml IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37恒温培养箱中30min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37恒温培养箱过夜。 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。
12、 . 转化克隆的筛选和鉴定 器材 旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴，制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。 试剂LB培养基，PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，65%甘油。 操作步骤 方法一：快速PCR筛选法 在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。 在0.2ml PCR 微量离心管中配制25l反应体系。 dd water 16l 10PCR buffer2.5l 25mM MgCl2 1.5l 2.5mmol/
13、L dNTP 2l 10mol/L Primer1 1l 10mol/L primer2 1l 模板质粒 用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗 Taq酶 0.5l 总体积 25l 根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序： 945min 941min 601min 721min50sgoto29 times 7210min PCR结束后，取10l产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。 按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒 提取到的质粒与原先的空载体再对比电泳，以进一步确认。 方法二：提质粒再PCR或酶切鉴定 在超净工作台中取
14、3支无菌摇菌管，各加入3mL LB，用记号笔写好编号。 在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基 上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mL LB的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。 37摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4冰箱中。 提取到的3管质粒样品可用PCR法扩增，或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源插入片断。 将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500mL菌液与500mL 65%甘油混合后-80保存。 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面
