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1、激光共聚焦显微镜原理和应用,激光扫描共聚焦显微镜 LSCMLaser scanning confocal microscope,以激光作为光源，激光器发出的激光通过照明针孔形成点光源，经过透镜、分光镜形成平行光后，再通过物镜聚焦在样品上，并对样品内聚焦平面上的每一点进行扫描。样品被激光激发后的出射光波长比入射光长，可通过分光镜，经过透镜再次聚焦，到达探测针孔处，被后续的光电倍增管检测到，并在显示器上成像，得到所需的荧光图像，而非聚焦光线被探测针孔光栏阻挡，不能通过探测针孔，因而不能在显示器上显出荧光信号。这种双共轭成像方式称为共聚焦。因采用激光作为光源，故称之为“激光扫描共聚焦显微镜”。,发展
2、历史,1957年，Malwin Minsky在其专利中首次阐明了激光共聚焦显微镜技术的基本工作原理，1967年，Egger第一次成功能共聚焦显微镜产生了一个光学横断面，1970年，Sheppard和Wilson 推出第一台单光束共聚集激光扫描显微镜1987年，White 和Amos在Nature杂志发表了“Confocal microscopy come of age”,标志着LSCM已成为科学研究的重要工具。,普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜图像的差别,激光共聚焦显微镜的基本原理,利用放置在光源后的照明针孔(P1)和放置在检测器前的探测针孔(P2)实现点照明和点探测；激光经过照明针孔形成点光
3、源，由物镜聚焦在样品焦面的某个点上，只有该点所发射 的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光线被探测器阻挡，不能到达PMT探测器，从而提高了成像效果。照明针孔和探测针孔 共焦，共焦点为被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。,LSCM的基本组成,激光发射器显微镜部分扫描装置计算机系统,基本结构激光光源,LASER“Light amplification by stimulated emission of radiation”受激发射的辐射光放大。,激光光源的产生,受激吸收：处于较低能级的粒子在受到外界的激发（即与其他的粒子发生了有能量交换的相互作用，如与光子发生非弹性碰撞），吸收了能量时，
4、跃迁到与此能量相对应的较高能级。自发辐射：粒子受到激发而进入的激发态，不是粒子的稳定状态，自发地从高能级激发态（E2）向低能级（E1）跃迁，同时产生光辐射的过程。众多原子以自发辐射发出的光，不具有相位、偏振态、传播方向上的一致，是物理上所说的非相干光。受激辐射：除自发辐射外，处于高能级E2上的粒子还可以另一方式跃迁到较低能级。当一个外来光子带来的能量正好对应能级差时（E2-E1），也会引发粒子以一定的概率，迅速地从能级E2跃迁到能级E1，同时辐射一个与外来光子频率、相位、偏振态以及传播方向都相同的光子的过程。,受激辐射,激光光源的产生,单色性好方向性好亮度高相干和偏振性好,激光的特征,激光就是
5、受激幅射产生的，激光束里处于相同状态的光子是相干的，偏振的，并沿同一方向传播的。,激光器：405，440，635，488，559,扫描器系统,针孔：confocal一个重要组成部分，它是放在检测器及激光光源前面的一个小孔，作用是控制光切片的厚度，对实现断层扫描成像，排除焦面杂散光起关键作用分光镜：作用是按照波长来改变光线的传播方向。发射荧光分色镜：作用是选择出一定的波长范围的光进行检测，不同型号的仪器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色器的部件主要由滤光片、棱镜和光栅三种类型。检测器：采用高灵敏度的光电倍增管，其检测的范围和灵敏度可根据强度进行连续调节。,荧光显微镜系统,类型：正置，倒置光
6、路：光源：汞灯、氙灯，观察分辨样品中产生荧光物质的成分与位置。源发滤光片：选择适合荧光物质激发波波长的范围 双色分光镜：初步分开激发和发射光组件、阻滤片：获得更纯的发射荧光 物镜：激发和发射都由同一物镜实现。目镜：10 用于LSCM的荧光显微镜：侧面有扫描器接口，装有微量步进马达，有防振装置，有光路转换装置，配高数值孔径的物镜。,计算机系统,数据采集、处理、转换、应用软件,基本功能,多种图像扫描方式2D:xy，xz，xt3D：XYZ，Xyt4D：XYZt光谱扫描多色荧光同时检测：图像分析与定量处理：3D重建，立体重建，断面轮廓分析。图像分析：特定区域的强度、周长的测量，以及延时观察分析t等。荧
7、光光谱拆分,组织和细胞中的荧光来源,自发荧光：指组织细胞不经过任何荧光染色便能在短波长光的激发下发射出的荧光，GFP就具有自发荧光，是标记靶蛋白的特异性荧光探针。荧光染色：很多荧光染料与组织细胞作用，能够在光的作用发出特征波长的荧光，借以观察组织细胞的形态结构、化学组成和功能。有些可做活体染色。免疫荧光：荧光抗体法产生荧光。外源性荧光物质进入组织内产生的荧光。某些药物诱发荧光：生物胺类能与某些醛类物质在一定条件下缩合而发生荧光。酶致荧光：某些酶的反应能够发射荧光。,LSCM主要用于测定具有荧光的样品，因此对本身没有特征荧光的生物样品，就需要用荧光标记的方法使样品待测物质具有荧光，然后再进行检测
8、。,荧光探针,荧光标记与荧光探针：采用一定的标记物，使样品待测物质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。这种组样品赋予特征荧光的操作过程称为荧光标记。荧光探针的种类：蛋白质、单糖和多糖探针，细胞器探针、核酸探针、细胞活性探针、膜结合受体探针等。,如何选择探针,根据实验目的确定需要检定的指标确定可供选择的荧光探针的范围：根据需要检测的指标，选择应成熟的探针或标记方法。可通过查找文献和试剂公司产品目录确定可以标记待测物的荧光探针的种类或范围。考虑荧光探针的特性：荧光探针与样品的反应特性（与待测分子或离子反应的选择性或专一性等），荧光探针的灵敏度和荧光强度，荧光探针标记后样品的光谱特征（需要
9、在仪器的检测范围内），荧光的稳定性，样品中多重荧光的相互影响（避免光谱交叉）。,荧光样品的制备要求,荧光标记反应特异性强，荧光信号定位准确保持样品应有的形态结构的完整性荧光信号响应百准确灵敏，具有可重复性荧光强度适度荧光稳定性好。样品的荧光分布均匀两种或两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉可以得到消除。图象背景干净，干扰杂质少。,荧光样品的制备过程,样品的预处理,组织切片样品的处理：活组织切片，无需固定，可观察和测定活性状态下的一些生理指标，缺点是保存条件高，时间短，切片厚。冰冻切片：荧光背景低，引入杂质干扰少。固定组织切片：易操作，样品易保存，但易引入干扰荧光。细胞样本制备：杂细胞的干扰实验结
10、果，需要注意鉴别细胞的种类和纯度。细胞密度约在20-80%，活的细胞需用专用培养皿。,用荧光探针标记样品,标记方式：直接标记，生物样品与荧光探针直接作用，使样品具有荧光。间接标记法：荧光探针将某些特定分子标记，这些特定分子再与细胞作用，使样品具有荧光，如免疫荧光法，荧光标记的药物。显微注射法：利用显微注射向细胞内导入荧光探针，此法得到的荧光细胞少，适合监测少量细胞。膜通透法：利用透膜剂，低渗培养液短期刺激增强探针跨膜能力，从而使探针进入细胞中。确定荧光探针标记样品的条件：标记探针的浓度，反应温度，时间等。,荧光探针标记的注意事项,荧光强度过高：看不清细胞结构细节，不利于形态观察，可降低探针浓度
11、，减少反应时间。荧光强度弱：荧光探针浓度过低，标记条件不当，探针溶解不充分，探针选择错误等。在操作过程中，避免对样品造成损伤防止影响实验结果荧光标记要避光进行。防止非特异性标记，设立正确的对照组。荧光标记后要尽快上机采集图像。,LSCM的优越性,动态连续扫描及三维图像重组 LSCM可以对对活细胞和组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描,来获得各个层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”。激光扫描共聚焦显微镜扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小。获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。与普通光学显微镜获得的图像相比，LSCM所得
12、到的重组三维图像清晰度高、立体感强,可通过计算机软件对细胞内所研究的结构进行各种测量，对细胞内的空间结构和某些物质在细胞内的定位方面的研究中有广泛的应用。,同时多种物质标记 利用LSCM，通过对膜上、胞浆内多种物质的荧光标记，可以实现在同一样品上同时进行多重物质的观察，比如检测细胞内钠、钙、镁等离子浓度的比率及动态变化,LSCM的优越性,瞬时分辨率高 可以实时动态观察活体组织标本。LSCM 的荧光检测器可以毫秒级或微秒级的速度检测荧光，即其时间分辨率极高，能对细胞内的分子进行功能性动态观察。LSCM技术可对活细胞在无损伤处理的情况下进行观察，跟踪活细胞内的物质或结构和生理过程随时间变化的情况，
13、得到实时动态的连续图像。,LSCM的优越性,高质量数字图像 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。LSCM以激光为光源，激光具有单色性强、方向性好、高亮度相干性好等优点，可以避免普通显微镜的缺点。一般常用的气体激光器如氩(Ar)氪(Kr)氦(He)氖(Ne)。由于LSCM的样品焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样就避免了传统光学显微镜由于光散射造成的图像信噪比降低，图像清晰度和分辨率不高的缺点。而且，LSCM的图像是以电信号的形式记录下来的，可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行各种图像处理。,LSCM的优越性,LSCM在生物医学
14、中的应用,组织和细胞中分子或结构的定位，定量分析：利用LSCM可以在细胞原位用特异的荧光标记探针标记出核酸、蛋白质、多肽、酶、激素、磷脂、多糖、受体等分子，实现对其定位、定性和定量检测，也可观察细胞及亚细胞形态结构。如在细胞原位检测核酸、原位检测蛋白，抗体及其他分子，检测细胞凋亡、细胞器观察及测定，检测细胞整合、观察细胞骨架，检测细胞间缝隙连接通讯等多种应用。标本的制备方法主要有免疫荧光组织和细胞化学法、荧光蛋白标记分子法，荧光细胞染料标记法等。LSCM不但可对单标记或双标记细胞及组织标本的共聚焦荧光进行定量分析，还可利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加形成组织或细胞中荧光标记结构的总体
15、图像，以显示荧光在形态结构上的精确定位。,原位检测细胞中的核酸,用于细胞核的定位及形态学观察，检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察等。常的荧光探针：PI,EB，DAPI,AO,TOTO-1等,荧光原位杂交（FISH）,利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。用标记有荧光的DNA或RNA为探针，在原位测组织细胞内特定的DNA或RNA片断，从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断。把荧光信号的高灵敏度、安全性、直观性和原位杂交的高准确性结合起来。,原位检测蛋白质及其它分子,常用荧光探针 FITC,TRITC,Cy3，Cy5等免疫荧光标记：将抗体标记上荧光素，与
16、细胞或组织内相应的抗原结合后，通过检测特征性的荧光，定位，定性、定量检测样品中的抗体。既有免疫反应的特异性，又有荧光检测的敏感性。,荧光蛋白：跟踪组织或细胞内基因表达及蛋白定位的标记物,GFP，绿色荧光蛋白，在任何活细胞中都表达，可作为活细胞的分子探针，GFP连接上目的基因后转染细胞，可分析目的基因的生物学功能和特性。可对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察，可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达，如某种转录因子的核转位，蛋白激酶C的膜转位，还可用于观察分子的运动，及蛋白之间的相互作用。,检测细胞凋亡,Annexin V/PI双染：Annexin
17、V是检测凋亡早期细胞膜损伤的方法，凋亡早期细胞膜膜磷脂失去平衡，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从细胞内侧翻转到外侧，暴露于细胞外环境中，Annexin V与磷脂具有高度亲和力，可与转移到膜外的PS结合。对于凋亡晚期细胞和死细胞，PI能透膜而使其染红。两者配合使用可以初步确定细胞的凋亡进程。,检测细胞器,标记线粒体：Rodamin 123，JC1,Mitotracker Green FM,Mito Tracker Red标记溶酶体：Lyso tracker green，Lyso tracker blue,Lyso tracker red标记内质网：DiOC6标记高尔基体：NBD C6-cera
18、mine,斑马鱼脑部的血管与神经元绿色：神经元红色：血管,蓝色细胞核，绿色微管,LSCM在生物医学中的应用,活体细胞和组织功能的实时动态监测：利用相应的特异性荧光标记所要观察的物质后，用LSCM可实时动态监测单个细胞不同部位或不同组织区域接受刺激后的整个变化过程。如：实时定量测定细胞内Ca离子的变化，测定细胞内PH变化、检测膜电位的变化、检测细胞内活性氧物种的产生、检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位、检测荧光共振能量转移(FRET)、等多种对活细胞的实时动态监测。,游离钙离子变化荧光探针,此类探针多为钙离子螯合剂，可用常用的探针Fluo-3，其乙酰羟甲基酯(AM)形式为不带电荷的亲脂性化
19、合物，易于渗透脂膜进入活细胞内，在胞内被非特异酯酶水解，释放出无荧光的游离酸形式的荧光探针分子，探针分子一旦与Ca离子结合便形成复合物，并产生较强的荧光，从而发挥其钙探针的作用。一般来说，电生理记录装置加摄像技术检测细胞内离子量变化的速度相对较快，但其图像本身的价值较低，而LSCM可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像。常用探针Fluo-3-AM，Indo-1,Fura-2，Calcium Green-1，Calcium Green-2等。,药物进入细胞的动态过程及定位分布,为检测药物分子、病毒、细菌等外界物质能否跨膜进入细胞（或组织），需要利用这些物质特异性的自发荧光或对其进行荧
20、光标记。这些具有荧光的物质与细胞（或组织）充分作用后，如果与细胞（或组织）结合，则细胞（或组织）中会有特征荧光出现，利用激光共聚集显微镜检测细胞（或组织）内该荧光出现的位置和含量，还可检测该物质跨膜进入细胞的动态过程。,荧光漂白技术,原理：使用强激光照射，将细胞内的一个区域的荧光分子漂白，然后观察未漂白的荧光分子的运动。GFP较适合用于光漂白研究的荧光分子：它比较亮，稳定，在活细胞内没有毒性，在使用低激光强度拍摄图像时漂白较少，其次，在使用高强度激光照射时，GFP的光漂白是非可逆的，并且GFP的光漂白不会造成细胞损伤，另外，分子融合技术将GFP与特定蛋白分子融合，使得光漂白技术可用于研究蛋白分
21、子在细胞内的运动。两种漂白实验：一是荧光漂白丢失（FLIP），观察漂白后的荧光丢失现象；二是荧光漂白恢复（FRAP），观察的荧光恢复现象。,荧光漂白丢失FLIP,将细胞内一个区域的荧光分子反复漂白，然后观察漂白区域外荧光丢失的情况。可以研究不同部位的荧光分子的转运或连续性，如GFP整合蛋白分子在不同细胞器内的分布等。,荧光漂白恢复（FRAP）,FRAP是利用高能量激光束将细胞内某一部分中选定靶区域的某种荧光淬灭，然后观察邻近相同的非淬灭荧光标记物重新扩散入该区域的速度和方式，从而分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。,荧光共振能量转移（FRET),用于研究细胞
22、内蛋白质分子间或蛋白质分子内的相互作用。可以获得两个蛋白分子之间相互作用的空间信息。关于蛋白分子的共定位，蛋白分子聚合体，转录机制，蛋白折叠等问题可通过FRET来解决。,LSCM在生物医学中的应用,长时程观察细胞迁移和生长：目前的LSCM的软件一般均可自动控制进行定时和定方式的激光扫描，新一代的LSCM探测效率提高，只需很小激光量就可达到较好的图像质量，从而减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤，因此可以用于数小时的长时间的定时扫描，记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。,激光共聚焦显微镜在各研究领域中应用,细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡等；
23、生物化学：酶、核酸、FISH、受体分析等；药理学：药物对细胞的作用及其动力学等；生理学：膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态等；遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断等；神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递等；微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构等；病理学及病理学临床应用：活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断等；生物学、免疫学、环境医学和营养学：免疫荧光标记（单标、双标）的定位，细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位等。,复习题,LSCM成像原理简述LSCM在生物医学中的应用,超微结构复习题,简述细胞核，线粒体，高尔基体，内质网，细胞膜，溶酶体的基本结构。线粒体嵴的类型、结构特点和意义线粒体肿胀和积水变，嵴内肿胀，线粒体肥大和增生，巨线粒体常见的线粒体、内质网包含物 粗面内质网肥大和增生的形态特征 粗面内质网脱粒和多聚核糖体解聚形态特征和意义微绒毛 形态特征 纤毛 形态特征 常见的病理改变类型常见的细胞连接类型，基本结构核体次级溶酶体的分类,共聚焦实验分组,电镜观察分组,
