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1、葡萄糖酸的发酵生产,生工本0901 寇凤雨,葡萄糖酸的性质,葡萄糖酸是葡萄糖衍生的糖酸,分子式为C6H12O7。为结晶状化合物，熔点131,呈弱酸性，溶于水，微溶于乙醇。在水溶液中转化为-葡萄糖酸内酯和 葡萄糖酸内酯的平衡混合物。,葡萄糖酸作为蓬松剂、凝固剂、鳌合剂、酸味剂而广泛应用于食品、医药、建筑等行业，葡萄糖酸与钠、钙、锌、亚铁等金属氧化物合成制得的葡萄糖酸盐可作为食品添加剂和营养增补剂添加到食品中。葡萄糖酸的金属络合物在碱性体系中广泛用作金属离子的掩蔽剂。葡萄糖酸钠可分为工业级，食品级和医药级目前我国市场价格分别在4300-4800/t，7800-8500元t，8800-10000元t
2、。,山东凯翔生物化工有限公司专业从事葡萄糖酸钠，葡萄糖酸内酯，衣康酸的研究、开发、生产和销售，拥有先进的生物发酵设备、一流的检测手段、现代化的科学管理级雄厚的技术力量，并通过了ISO9001国际质量管理体系认证、ISO14001国际环境管理体系认证、OHSAS18001国际职业健康安全管理体系认证。公司年产葡萄糖酸钠35000吨，是国内最大的生产供应商，生产的“凯翔”牌葡萄糖酸钠，葡萄糖酸内酯各项技术指标均达到国际先进水平，产品畅销美洲、欧洲、东南亚、中东等国家和地区。,上海卡博工贸有限公司山东新华医药集团山东中舜科技发展有限公司,葡萄糖酸的发现,1880年Boutroux发现使用醋化醋杆菌发
3、酵葡萄糖能够产生一种不挥发的酸，后来确定为葡萄糖酸。以后的许多研究者报道了其他几种细菌也能够产生葡萄糖酸和酮基葡萄糖酸。上个世纪30年代以前，生产葡萄糖酸主要是使用细菌。1922年，Molliard发现，利用霉菌也能够发酵葡萄糖酸，后来人们知道黑曲霉、米曲霉、文民曲霉和青霉都有氧化葡萄糖产生葡萄糖酸的能力。,葡糖糖酸工艺的发展,Bernhager在1924年发现，采用中和生成酸的方法，黑曲霉能够高效地将葡萄糖转化为葡萄糖酸，而添加碳酸钙是最好的。在较低温度，限制氮源的条件下，生成的葡萄糖酸几乎可以达到理论产率。,1952年，Blom等发明了添加NaOH、维持pH65以上的方法生产葡萄糖酸钠，使
4、糖的转化率达95以上，发酵时间缩短至20小时以内，这种工艺形成了现代工业深层发酵的基础。,1999 年,黄道震等以葡萄糖含量为30%的发酵培养基接种10%的黑曲霉种子液,通气、220 r min-1，搅拌、流加氢氧化钠溶液控制p H 值6.06.5、温度32 34、发酵20 h,残糖可降至1 g L-1 以下。2002 年,Anastassiadis 等利用筛选得到的短梗霉(Aureobasi di um p ul l ul ans)在连续式搅拌发酵罐中进行了静息细胞和固定化细胞的葡萄糖酸连续转化实验,葡萄糖酸浓度可达260 g L-1,最高生成速率为19 gL-1.h-1。,葡萄糖酸发酵的生
5、物工艺,黑曲霉发酵能力的特性不仅由其遗传特性决定，其所处的环境条件也决定了发酵法生产葡萄糖酸的产量，发酵法生产葡萄糖酸产量的高低除了受生产菌种的影响外，培养基的组成和培养条件对产量的影响也很大。黑曲霉发酵水平的提高，主要依赖于菌种选育及发酵工艺(培养基和培养条件)的优化，这两个环节是相辅相成的。,菌种选育按照生产要求，根据微生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选获得高产变株而达到提高发酵水平的目的；而发酵工艺的优化是改变培养基的在发酵过程中改变培养温度、通气量、搅拌转速、调节pH等措施，从而强化微生物的生物合成的全过程，提高发酵产量。通过工艺优化，改进发酵培养基成份和发酵
6、条件，创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力，从而显著提高发酵产量,高产菌株的筛选,紫外线诱变取黑曲霉P-9的孢子，用无菌生理盐水制成108个/mL的孢子悬液。取 2mL孢子悬液于无菌培养皿中，铺成一层薄层，于暗室内30w紫外灯下20cm处照射8min。取照射液进行适当稀释，涂布于选择培养基，用黑纸包裹，30恒温避光培养4d，待长出孢子后，将孢子点种于筛选培养基，挑选在菌落周围出现较大蓝色圈的菌株，分别进行发酵并测定葡萄糖氧化酶活力。,葡萄糖氧化酶酶活力的测定 本研究采用分光光度计分析法测定葡萄糖氧化酶活性。反应混合液含2mL1mol/L 葡萄糖（0.1mol/L的柠檬酸
7、钠-磷酸缓冲液配制，PH=5.0)，1mL 0.1苯醌和100uL 粗酶液，反应液于35 下保温反应10min，于290nm 处测定形成的氢醌的量。葡萄糖氧化酶的单位（U）定义为35 PH=5.0 下每克菌体每分钟产生1umol氢醌的酶量。,蓝圈法的原理是微生物产生的葡萄糖氧化酶将培养基中 的葡萄糖转化为葡萄糖酸，葡萄糖酸与KI反应将I-离子还原为I元素，I与培养基中的可溶性淀粉反应形成蓝色化合物而使菌落周围出现蓝色圈，蓝色圈的大小与葡萄糖氧化酶的产量成正相关。该方法可以作为葡萄糖氧化酶产生菌的高通量筛选方法，大大提高葡萄糖氧化酶产生菌的诱变育种效率。,葡萄糖氧化酶产生菌的诱变选育黑曲霉P-9
8、 经过紫外线照射处理，共获得8 个耐受2-脱氧-D-葡萄糖的突变菌株，分别是U-15、U-17、U-56、U-69、U-78。5个耐2-脱氧-D-葡萄糖突变株经蓝圈筛选和发酵测定，有3个菌株的葡萄糖氧化酶产量高于出发菌株，产酶水平最高的是U-69 菌株，为是28.7U/g出发菌株P-9倍，结果见表1。,表1 经过紫外线诱变所获得的突变菌株的葡萄糖氧化酶活性,葡萄糖酸发酵生产一 材料和仪器1 菌种 黑曲霉（U-69 菌株）2 培养基(1)查氏培养基(g L-1):蔗糖30,NaNO3 4 g,MgSO4 7H2O 0.5g,KCl 0.5g;FeSO4 0.1 g,K2 HPO4 1 g,琼脂2
9、0 g,p H 值5.5,温度31。(2)种子培养基(g L-1):葡萄糖(水解糖)40,麸皮32,(N H4)2 HPO4 0.4 g,KH2 PO4 0.2 g,MgSO4 7H2O 0.2g,CaCO3 10 g,p H 值5.6。(3)发酵培养基(g L-1):葡萄糖(水解糖)100 300,(N H4)2 HPO4 014,KH2 PO4 012,MgSO4 7H2O 0.15 g,CaCO3 2781,p H 值5.6。,主要仪器 SHZ-82 型恒温振荡器 SKP-201B 型电热恒温箱 SBA-240C 型生物传感分析仪 FLC-23 型超净工作台 722S 型可见分光光度计
10、TD52-2 型自动平衡离心机 10 L 发酵罐,培养方法种子培养 250 mL 三角瓶中装液量为30 mL,接种后置于 30、220 r min-1摇床培养1820 h。摇瓶发酵培养 取孢子悬液接入发酵培养基中(250 mL 三角瓶中 装液量为30 mL)置于33、250 r min-1 摇床 培养,发酵结束后测残糖及葡萄糖酸的浓度。发酵罐发酵 10 L 发酵罐装料7 L,接种10%的黑曲霉种子悬 液,搅拌转速250 r min-1,无菌空气流量 0.4m3 h-1,维持温度33,流加30%的碱液维持pH5.6。残糖含量降至015%以下时,结束发酵。,发酵过程影响葡萄糖酸产量的因素,葡萄糖浓
11、度发酵液PH值溶氧接种量,葡萄糖酸浓度的测定 发酵过程中葡萄糖酸的生成会导致发酵液p H 值下降,利用NaOH 与葡萄糖酸中来维持发酵p H 值时,生成葡萄糖酸的钠盐,其葡萄糖酸根可与Cu2+、Fe3+等金属离子发生络合反应,加热后呈现一定的色,660 nm 波长下可测定其吸收值,由标准曲线方程推算可知葡萄糖酸的浓度。,EDTA 定钙法，发酵过程中葡萄糖酸的生成导 致发酵液p H 值下降,利用Ca(O H)2 及CaCO3 与葡萄糖酸中和来维持发酵p H 值时,生成葡萄糖酸的钙盐,通过直接测定发酵液中钙离子的含量可折算得到生成的葡萄糖酸浓度(W G)。cE V E M W G=-V S 式中:
12、cE 为所用EDTA 的浓度,mol L-1;M 为葡萄糖酸的摩尔质量,196 g mol-1;V E 为所用EDTA 的体积,mL;V S 为所取用的待标定溶液的体积,mL。,葡萄糖含量的控制方式葡萄糖在较高含量下,对许多微生物的生长和代谢都有抑制作用,使菌体生长速率和产物生成速率处于较低水平,发酵时间大大延长。摇瓶实验在葡萄糖含量分别为10%、20%和30%的发酵培养基中分别添加27 g L-1、54 g L-1、81 g L-1CaCO3,摇瓶发酵30 h,考察葡萄糖含量对黑曲霉产酸的影响,结果见表2,表2葡萄糖含量对摇瓶发酵产酸的影响,由表1 可见,随着葡萄糖含量的增加,葡萄糖平均消耗
13、速率加快,这说明高含量的葡萄糖对黑曲霉的生成和代谢没有抑制作用。从发酵糖酸转化率和葡萄糖酸平均生成速率上来看,糖含量为20%时最高。若采用30%葡萄糖摇瓶,培养基中葡萄糖浓度和CaCO3 浓度太高,培养基粘度太大,严重阻碍了氧的溶解与传递,副产物生成量增加,导致转化率和葡萄糖酸平均生成速率下降。为此,可以采取初糖含量为20%、分批流加葡萄糖至30%和分批添加CaCO3 至总量81 g L-1 的方法来进行发酵工艺控制。,pH值的控制方式黑曲霉在葡萄糖酸的生成过程中p H 值会不断下降,若降至415 以下会导致柠檬酸的生成,为此需对发酵过程中p H 值进行控制,一般可通过添加碳酸盐、金属氧化物和
14、碱来实行。在10 L 发酵罐(装液量615 L,葡萄糖含量20%)中分别采用NaO H、Ca(OH)2、CaCO3 来控制p H 值,考察了不同控制方式对黑曲霉发酵产酸的影响,结果见表3。,表3 10 L 发酵罐中pH值控制方式对发酵产 葡萄糖酸的影响,由表2 可见,发酵过程中流加NaOH 控制p H值,各项指标都达最高,发酵时间最短;流加Ca(OH)2乳浊液和添加CaCO3 控制p H 值的指标接近,但比流加NaOH 要低很多。当临近终点时,发酵液出现大量白色的葡萄糖酸钙结晶颗粒,使得发酵产物的浓度受到限制,无法得到高浓度葡萄糖酸。,比较3 种pH值控制方式,若是要生产葡萄糖酸钠,应采取流加
15、NaOH来控制pH值,发酵时间短,p H值控制精确,产物含量可达20%以上;若是生产葡萄糖酸或其它盐类最好采取流加Ca(OH)2乳浊液或添加CaCO3 来控制,虽然发酵时间长、产物浓度受到限制,但后处理阶段因钙离子可与硫酸生成硫酸钙沉淀,减轻了阳离子交换负荷,产品纯度也高,但添加CaCO3 来控制pH值时,pH值控制范围受CaCO3 质量的影响,一般来说,轻质CaCO3可将pH值控制5.05.5 之间。,溶氧的变化与控制方式10 L 发酵罐中溶氧与葡萄糖酸的动态变化曲线见图2。,由图2 可见,发酵开始后,溶氧含量一直下降,第8 h 达到最低点,而后逐步升高;葡萄糖酸浓度自发酵开始后就一直上升,
16、但04 h 和1434 h 这两段曲线斜率较大,葡萄糖酸生成速度较快,414 h 曲线的斜率较小,并恰好与溶氧曲线上溶氧含量40%以下的阶段相一致,也就是说,较低的溶氧含量对葡萄糖酸的生成有抑制作用。溶氧曲线还表明,接种后,菌体生长几乎未经延滞期就直接进入对数生长期,第910 h到达对数期末。进入稳定期后,溶氧含量回升。3044 h,生长几乎停止,而菌体内酶活稳定,因此溶氧含量曲线相对平缓。44 h 后,酶活逐步降低,溶氧含量曲线继续上升,且葡萄糖酸浓度曲线斜率降低。,溶氧的控制方式针对图2 中溶氧的变化情况,通过控制搅拌转速来维持溶氧含量在50%左右。溶氧含量低于50%时,提高搅拌转速;高于
17、50%时,降低搅拌转速。这样可以维持较高的葡萄糖酸生成速率,并降低搅拌能耗。溶氧控制对黑曲霉发酵的影响见表4。,表4溶氧控制对发酵产葡萄糖酸的影响,注:p H 值51 6,流加30%NaOH 溶液控制;初糖浓度200 g L-1,发酵时间40h,由表3 可见,采取调整搅拌转速来控制溶氧含量,可以缩短发酵时间,葡萄糖酸浓度、葡萄平均消耗速率和葡萄糖酸平均生成速率都会提高,产酸性能得到改善。虽然变化幅度不大,但其最大优势是节能,发酵过程只有在414 h 时间段内需要加大搅拌转速,其余大部分时间都在较低转速下运行。,接种量对葡萄糖酸产量的影响 图 3是不同接种量下的葡萄糖酸产量，从图3 可以看出，接
18、种量对菌株合成葡萄糖酸有很大的影响。,接种量对菌株合成葡萄糖酸的影响,葡萄糖酸（g/L),黑曲霉合成葡萄糖酸最佳接种量为10，当接种量不足时，由于菌体生长慢，产生葡萄糖氧化酶能力差，葡萄糖酸的产量则低，当接种量过大时，由于菌体生长快，消耗过多营养，导致产生葡萄糖氧化酶能力差，葡萄糖酸的产量也低。,结论,(1)葡萄糖含量对黑曲霉产葡萄糖酸没有抑制作用,但如果葡萄糖含量过高,且用CaCO3 控制p H 值时,则发酵液粘度增大,会严重阻碍发酵液中氧的溶解和传递。较好的葡萄糖控制方式是:总糖含量30%,初糖含量20%,每当残糖降至15%时补加5%的糖。,(2)p H 值控制可采取流加30%NaOH 溶
19、液流加25%30%Ca(OH)2 乳浊液、分批添加CaCO3 3 种方式。流加NaO H 溶液,发酵速率快,转化率高,最适合葡萄糖酸钠的生产;流加Ca(OH)2或分批添加CaCO3适合于葡萄糖酸(钙)、葡萄糖酸内酯、葡萄糖酸盐(钠盐除外)的生产。(3)通过调整搅拌转速控制溶氧含量50%左右,产酸性能好、搅拌能耗低,值得推广应用。（4）通过控制接种量，黑曲霉合成葡萄糖酸钙最佳接种量为10此时产量最高。,谢谢,1、最孤独的时光，会塑造最坚强的自己。2、把脸一直向着阳光，这样就不会见到阴影。3、永远不要埋怨你已经发生的事情，要么就改变它，要么就安静的接受它。4、不论你在什么时候开始，重要的是开始之后
20、就不要停止。5、通往光明的道路是平坦的，为了成功，为了奋斗的渴望，我们不得不努力。6、付出了不一定有回报，但不付出永远没有回报。7、成功就是你被击落到失望的深渊之后反弹得有多高。8、为了照亮夜空，星星才站在天空的高处。9、我们的人生必须励志，不励志就仿佛没有灵魂。10、拼尽全力，逼自己优秀一把，青春已所剩不多。11、一个人如果不能从内心去原谅别人，那他就永远不会心安理得。12、每个人心里都有一段伤痕，时间才是最好的疗剂。13、如果我不坚强，那就等着别人来嘲笑。14、早晨给自己一个微笑，种下一天旳阳光。15、没有爱不会死，不过有了爱会活过来。16、失败的定义：什么都要做，什么都在做，却从未做完过
21、，也未做好过。17、当我微笑着说我很好的时候，你应该对我说，安好就好。18、人不仅要做好事，更要以准确的方式做好事。19、我们并不需要用太华丽的语言来包裹自己，因为我们要做最真实的自己。20、一个人除非自己有信心，否则无法带给别人信心。21、为别人鼓掌的人也是在给自己的生命加油。22、失去金钱的人损失甚少，失去健康的人损失极多，失去勇气的人损失一切。23、相信就是强大，怀疑只会抑制能力，而信仰就是力量。24、那些尝试去做某事却失败的人，比那些什么也不尝试做却成功的人不知要好上多少。25、自己打败自己是最可悲的失败，自己战胜自己是最可贵的胜利。26、没有热忱，世间便无进步。27、失败并不意味你浪
22、费了时间和生命，失败表明你有理由重新开始。28、青春如此华美，却在烟火在散场。29、生命的道路上永远没有捷径可言，只有脚踏实地走下去。30、只要还有明天，今天就永远是起跑线。31、认真可以把事情做对，而用心却可以做到完美。32、如果上帝没有帮助你那他一定相信你可以。33、只要有信心，人永远不会挫败。34、珍惜今天的美好就是为了让明天的回忆更美好。35、只要你在路上，就不要放弃前进的勇气，走走停停的生活会一直继续。36、大起大落谁都有拍拍灰尘继续走。37、孤独并不可怕，每个人都是孤独的，可怕的是害怕孤独。38、宁可失败在你喜欢的事情上，也不要成功在你所憎恶的事情上。39、我很平凡，但骨子里的我却
23、很勇敢。40、眼中闪烁的泪光，也将化作永不妥协的坚强。41、我不去想是否能够成功，既然选了远方，便只顾风雨兼程。42、宁可自己去原谅别人，莫等别人来原谅自己。43、踩着垃圾到达的高度和踩着金子到达的高度是一样的。44、每天告诉自己一次：我真的很不错。45、人生最大的挑战没过于战胜自己！46、愚痴的人，一直想要别人了解他。有智慧的人，却努力的了解自己。47、现实的压力压的我们喘不过气也压的我们走向成功。48、心若有阳光，你便会看见这个世界有那么多美好值得期待和向往。49、相信自己，你能作茧自缚，就能破茧成蝶。50、不能强迫别人来爱自己，只能努力让自己成为值得爱的人。51、不要拿过去的记忆，来折磨
24、现在的自己。52、汗水是成功的润滑剂。53、人必须有自信，这是成功的秘密。54、成功的秘密在于始终如一地忠于目标。55、只有一条路不能选择那就是放弃。56、最后的措手不及是因为当初游刃有余的自己57、现实很近又很冷，梦想很远却很温暖。58、没有人能替你承受痛苦，也没有人能抢走你的坚强。59、不要拿我跟任何人比，我不是谁的影子，更不是谁的替代品，我不知道年少轻狂，我只懂得胜者为。60、如果你看到面前的阴影，别怕，那是因为你的背后有阳光。61、宁可笑着流泪，绝不哭着后悔。62、觉得自己做得到和做不到，只在一念之间。63、跌倒，撞墙，一败涂地，都不用害怕，年轻叫你勇敢。64、做最好的今天，回顾最好的
25、昨天，迎接最美好的明天。65、每件事情都必须有一个期限，否则，大多数人都会有多少时间就花掉多少时间。66、当你被压力压得透不过气来的时候，记住，碳正是因为压力而变成闪耀的钻石。67、现实会告诉你，不努力就会被生活给踩死。无需找什么借口，一无所有，就是拼的理由。68、人生道路，绝大多数人，绝大多数时候，人都只能靠自己。69、不是某人使你烦恼，而是你拿某人的言行来烦恼自己。70、当一个人真正觉悟的一刻，他放弃追寻外在世界的财富，而开始追寻他內心世界的真正财富。71、失败并不意味你浪费了时间和生命，失败表明你有理由重新开始。72、人生应该树立目标，否则你的精力会白白浪费。73、山涧的泉水经过一路曲折
26、，才唱出一支美妙的歌。74、时间告诉我，无理取闹的年龄过了，该懂事了。75、命运是不存在的，它不过是失败者拿来逃避现实的借口。76、人总是在失去了才知道珍惜！77、要铭记在心：每天都是一年中最美好的日子。78、生活远没有咖啡那么苦涩，关键是喝它的人怎么品味！每个人都喜欢和向往随心所欲的生活，殊不知随心所欲根本不是生活。79、别拿自己的无知说成是别人的愚昧！80、天空的高度是鸟儿飞出来的，水无论有多深是鱼儿游出来的。81、思想如钻子，必须集中在一点钻下去才有力量。82、如果我坚持什么，就是用大炮也不能打倒我。83、我们要以今天为坐标，畅想未来几年后的自己。84、日出时，努力使每一天都开心而有意义
27、，不为别人，为自己。85、有梦就去追，没死就别停。86、今天不为学习买单，未来就为贫穷买单。87、因为一无所有这才是拼下去的理由。88、只要我还有梦，就会看到彩虹!89、你既认准这条路，又何必在意要走多久。90、尽管社会是这样的现实和残酷，但我们还是必须往下走。91、能把在面前行走的机会抓住的人，十有八九都会成功。92、你能够先知先觉地领导产业，后知后觉地苦苦追赶，或不知不觉地被淘汰。93、强烈的信仰会赢取坚强的人，然后又使他们更坚强。94、人生，不可能一帆风顺，有得就有失，有爱就有恨，有快乐就会有苦恼，有生就有死，生活就是这样。95、好习惯的养成，在于不受坏习惯的诱惑。96、凡过于把幸运之事归功于自我的聪明和智谋的人多半是结局很不幸的。97、如果我们一直告诫自己要开心过每一天，就是说我们并不开心。98、天气影响身体，身体决定思想，思想左右心情。99、不论你在什么时候结束，重要的是结束之后就不要悔恨。100、只要还有明天，今天就永远是起跑线。,
