体内药分复习资料.docx

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1、体内药分复习资料体内药物分析 整理者：王思雨 绪论 1.体内药物分析是一门研究生物机体中质与量变化规律的分析方法学，是药物分析的一个重要分支。 2.生物样本包括生物体的各种器官、组织和体液。 3.分析对象：母体药物及其代谢产物、必要的内源物质、与之相关的其他药物。 4.体内药物分析的任务：分析方法学的研究和完善、体内药物的测定和研究、内源性物质的测定和研究 5.体内药物分析的特点：干扰物质多、样品量少、不能重复取样、被测成分浓度低、要求快速提供结果、有一定的仪器设备、工作量大、待测物的易变性。 第一章 1.选取生物样品的一般原则：能反映药物浓度与药物效应之间的关系、易获得、便于处理，适合于分析

2、、根据不同目的与要求 2. 血药总浓度 3.当药物与血浆蛋白的结合率稳定时，血药总浓度可以有效地表示游离药物浓度 样品处理： 血浆 (plasma) 全血 + 抗凝剂2500至3000rpm离心510min上清液 血清 (serum) 全血放置30min至1h2500至3000rpm离心510min上清液 全血 (whole blood) 全血 + 抗凝剂混合 4.尿液：收集服药后一定时间内尿样，记录体积，混合均匀后取一定量, 测定尿中药物浓度，计算一定时间内尿中药物的累计量。 尿中药物浓度变化较大，其变化不直接反映血液中药物浓度，因此，两者相关性较差，在药动学、生物利用度研究方面应用较少。

3、用于：药物剂量回收，肾清除率，代谢物类型研究，及人群代谢分型研究。 5.唾液：漱口15min后收集口内自然流出或经舌在口内搅动后流出的混合唾液，离心后取上清液。 与血浆药浓相比，唾液中药物浓度变化较大，且浓度较低。蛋白含量低，内源性物质少，便于前处理。 6.组织器官 l 新药临床前药动学研究 l 临床中毒死亡的原因分析、司法鉴定 l 通常需要先制备组织匀浆 7.头发：主要用于体内微量元素的分析、滥用药物和兴奋剂检测、毒物分析 8.生物样品取样：包括服药前空白血样、在曲线的峰前至少4个点、峰后6个及以上，峰附近应有足够的点，总采样点不少于12个。取样持续到3-5个半衰期或者血药浓度为C max

4、的1/10-1/20。 治疗药物浓度监测时，需连续给药，经过5个半衰期，血浓达到稳态后取样。 9.样品预处理目的： 使药物或代谢物游离，便于测定总浓度；使被测物纯化、浓集；消除干扰；防止对分析仪器的污染。 10 常用去蛋白的方法：蛋白质沉淀法和组织酶消化法 蛋白质沉淀法 ： l 生成不溶性盐：酸类 重金属盐 l 盐析和脱水：中性盐2SO4 、NaCl ） 能与水混溶的有机溶剂 11.缀合物的水解：含有羟基、氨基、羧基、巯基的药物或代谢物分子与葡萄糖醛酸结合成苷，与硫酸形成酯。这些缀合物的极性均较母体大，亲水性强，不易被有机溶剂提取，需进行水解处理。 l 酸水解 ( 简便、快速，但专一性差) l

5、 酶水解(-葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶) 12.有机破坏：有些生物样本需通过有机破坏的方法使被测游离。 l 干法破坏 l 湿法破坏 13.游离药物分离：平衡透析法 超滤法 超速离心法 14.提取净化 ：液-液萃取 和 液-固萃取 l 液-液提取 (liquid-liquid extraction, LLE) ，选用与水不相混溶的有机溶剂进行提取。 溶剂提取的关键问题是：提取选择性和提取率的重复性 。 提取效率与分配系数及提取溶剂体积有关 15.影响提取率的因素 水相pH 当pH=pKa 时, 50%药物以非电离形式存在，欲使药物以游离状态存在，则必须调整样本的pH值。 有机溶剂：要求对未电离部分

6、可溶而对已电离部分不溶；沸点低；与水不混溶，无毒；不易燃烧；不易乳化；具有较高的化学稳定性和惰性；不影响紫外检测。 离子强度：在水相中加中性盐，如NaCl，可增加离子强度，使溶液中水分子与无机离子强烈缔合，导致与药物缔合的水分子减少，使药物在水相中溶解度变小，有利于有机溶剂提取 16.离子对提取法：被测物Q+ 与反离子X形成离子对 QX，增强了药物的脂溶性，可被有机溶剂提取。 常用反离子： 测定碱性药物(阳离子)采用烷基或芳基的磺酸盐(庚烷磺酸钠等)，无机酸根； 测定磺酸、硫酸、羧酸类药物或葡萄糖醛酸苷采用412个C的烷基铵，如四丁基铵等 17.提取技术 试管内操作，一般提取一次，至多两次。有

7、机溶剂与水的体积比一般为1:11:3 。 18避免乳化问题：轻摇 ；滤除不溶性物质 ；避免高pH ；避免使用易乳化的溶剂对，如水-己烷 加适量固体NaCl 。 19液-固提取，主要指固相萃取 固相萃取小柱有子弹型和针筒型。 纯化样品的方式有选择性萃取和选择性冲洗。 提取溶剂的蒸发方法：抽真空法、通气流法、离心浓缩系统。 20.GC中衍生化目的 增加组分的热稳定性和挥发性 减少被测组分在样品处理中因吸附性强而导致的损失 改善被测组分的色谱行为 增加被测物的检测灵敏度和选择性 21.HPLC衍生化目的：增加组分的检测灵敏度；改进组分的色谱行为 。 衍生化方法：柱前衍生化 、柱后衍生化 第3章 分析

8、方法 1建立分析检测方法的主要依据： 待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况；分析测定的目的与要求；生物样品的类型与预处理方法；实验室条件。 2.选择样品预处理方法首先应考虑： 待测药物的理化性质；药物在生物体内的存在状况；药物在生物体内的生物转化(代谢)途径 3.分析方法的选择 生物样品中的药物浓度决定分析方法的首要因素。 分析方法建立之前,应查阅文献资料充分了解药物在体内的动力学过程，使所拟定的分析方法 避免受到代谢产物的干扰，适用于实际生物样品测定 4.检测条件的筛选：标准物质 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度 5.在进行分

9、离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下： 1空白溶剂试验 溶剂(方法特异性)，提取回收率以及最低检测浓度； 2空白生物基质试验 endogenous compounds(方法特异性)，内源性物质的干扰； 3模拟生物样品试验 方法效能指标 4实际生物样品测试 代谢产物(方法特异性) 理想的预处理结果是，背景干扰低，被测物回收率高且稳定。 6.分析方法验证的内容与要求 l 验证 (validation) 分析方法的可行性与可靠性 l 使用的技术指标效能指标 l 使用的样品通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样品 内容： 首先为分析方法的验证 特异性、精密

10、度与准确度、回收率、定量限与检测限、溶液稳定性 其次为生物基质中待测药物稳定性的验证室温放置、冷冻、冻-融循环 7.方法特异性：指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力，涵盖专属性和选择性。 证明内源性物质、相应的代谢物、降解产物以及其他共用药物不干扰样品的测定。 8.标准曲线 calibration curve or working curve 生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性 线性范围标准曲线的最高与最低浓度的区间 在定量范围内，模拟生物样品的浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。 9.标准曲线用模拟生物样品建立 要求：线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品中的药

11、物浓度； 不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度 10准确度：系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度。 一般用方法回收率表示、也有用相对误差表示 M-AM相对误差，RE=100=RR-100回收率，RR=100AA 限度要求 方法回收率应在85%115% (LOQ附近80%120%) RE在15% (LOQ附近为20%) 11. 方法精密度(precision )，系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度。 表示该分析方法的可重复性(reproducibility) 用相对标准差表示，RSD一般应15%，在LOQ附近RSD应20%。 12.方法定量限(li

12、mit of quantitation，LOQ)，系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度。 标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点LOQ)。 要求：应能满足测定35个消除半衰期后或Cmax的1/10-1/20时的生物样品中的药物浓度 准确度在80%120%(或RE在20%的范围内)；RSD20% 13. 稳定性包括方法稳定性和样品稳定性 方法稳定性方法的耐用性 样品稳定性生物样品的存放条件和时间、冻-融循环 要求 准确度RR 85%115%，RSD15% 14.萃取回收率：是指从生物样品基质中回收得到分析药物的响应值与标准物质产生的响应值的百分

13、比。 萃取回收率与方法回收率的意义不同： 萃取回收率考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失 方法回收率采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度 限度要求萃取回收率一般应50% ；高、中浓度的RSD应15% ；低浓度的RSD应20%。 第4章 高效液相和液质联用 1.HPLC的组成：输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理和计算机控制系统。 2.分离因子a对分离度的影响较大，选择合适的流动相对提高分离度具有重要的作用； 反相色谱流动相的选择，主要考虑有机相种类与比例、流动相pH值和离子强度。 3.如何快速摸索流动相条件？ 为快速找到适宜的有机相与水相的比例，一般先用强溶剂洗脱一定时间

14、，以保证非极性强保留成分完全被洗脱，然后以10%的比例递减有机相比例；或采用梯度洗脱进行首次实验。 4.流动相pH值的选择 ？ 采用反相色谱法分离弱酸性或弱碱性药物时，通过调节流动相的pH值，可抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形，此技术即反相离子抑制技术。 物质以分子形式存在，保留的时间较长；以离子形式存在，保留时间段。在pKa附近时，保留时间变化较大。建立一个耐用的方法，流动相的pH至少与被测物的pKa相差1个pH单位。 Tips：当流动相中缓冲液浓度较高或有机相比例较高时，选择甲醇比乙腈更可取，因前者对缓冲盐的溶解度较后者大。 特别应注意：缓冲液浓度和 pH值是由流动

15、相的水相部分测得的，不要将水相与有机相混合后测定 5.超高效液相 特点：高分辨率、高速度、高灵敏度 6.高效制备液相色谱 三种类型：半制备或小规模制备型(100 mg)；制备型(O.1100 g) ；大规模制备型(100 g) 色谱柱内径：1040mm 柱长为1030cm 填料粒径常：540m 7.液质联用(LC-MS) 接口技术 接口的主要作用：将流动相及样品雾化，分离除去大量的流动相分子；使样品分子电离。 常用的接口：电喷雾接口ESI 、大气压化学离子化接口APCI 、基质辅助激光解吸离子化接口MALDI 质量分析器 l 四极杆质量分析器，quadrupole mass analyser

16、l 离子阱质量分析器，ion trap, IT l 飞行时间质量分析器，time of flight, TOF 8.基质效应，基质对样品的测定常有显著的干扰，并影响测定结果的准确性，这些影响和干扰被称为 l 产生机制：LC-MS中的基质效应是由样品的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率所致，表现为离子增强或抑制作用。 l 来源：基质效应主要来源于生物样品的内源性组分，包括离子颗粒物成分、强极性化合物和各种有机化合物。最主要的为磷脂。还有样品前处理过程引入。 评定基质效应：柱后灌注法、提取后添加法 9. 采用提取后添加法，在评定基质效应的同时可考察提取回收率和方法过程效率。 A溶液：由纯溶剂配制

17、的标准品溶液； B溶液：取空白生物样品，按前处理方法进行处理后添加标准品溶液； C溶液：取空白生物样品，添加标准品溶液后，按前处理方法进行处理。 由溶液A、B所得响应值计算基质效应(ME=B/A)； 溶液B、C所得响应值计算提取回收率； 溶液A、C所得响应值计算方法过程效率 结果：ME小于100%时表明有离子抑制作用；ME大于100%时表明存在离子增强作用； 一般ME在85%115%之间，基质效应可以忽略。 10.基质效应的消除或降低？ 样品前处理；同位素内标；色谱分离；质谱分析 第七章 手性色谱 1.手性对映体拆分方法：手性固定相法、手性衍生化法、手性流动相添加剂法 手性固定相法CSP：通过

18、物理吸附或化学键合的方法把手性化合物涂布或键合到固相载体上的方法。 II型比I型的相对滞后。 固定相的种类：Pirkle型手性固定相 、聚合物手性固定相 、蛋白质类手性固定相、多糖类手性固定相、大患抗生素、冠醚类、环糊精、分子印迹配位交换 手性衍生化法CDR：手性药物对映体在分离前与高光学纯的的衍生化试剂反应，形成非对映体。根据非对映体在理化性质上的差异，在非手性柱上实现分离。 手性流动相添加剂法：是将手性试剂添加到流动相中，手性添加剂与药物对映体对所形成的立体选择性非对映体配合物模型，实现对映体的分离。 第章 免疫分析法 基本原理：免疫反应为抗原-抗体结合反应，当抗原或标记抗原遇到相应的抗体

19、时产生一系列的抗原-抗体反应，形成抗原-抗体结合物。 在一个反应体系中，当抗体量一定时，抗原与标记抗原就与抗体发生竞争结合。 Ag*和Ab量是固定的，当Ag*与Ag对有限量的Ab进行竞争型结合时， Ag*与Ab结合形成 Ag*-Ab结合物的量取决于变量Ag，Ag*-Ab与Ag的量呈负相关。 这种特异的竞争性抑制的数量关系是免疫分析的定量基础。 特异性抗体、标记抗原、未标记抗原是三种基本试剂。 抗原：具有免疫原性和抗原特异性。 标准抗原：制作标准曲线用的待测物的标准品以及制备标记抗原用的纯抗原。 可分为：完全抗原 具有免疫活性的大分子物质，可直接免疫动物产生抗体。 半抗原分子量小于1000的小分

20、子物质本身不具有抗原性，需与蛋白质或多肽结合后才具有免疫原性。 人工完全抗原的制备： 半抗原+蛋白质+偶联剂人工完全抗原 、兔血清蛋白，它们具有价廉，免疫活性高，化学性质稳定，溶解度好，连接基因多等优点。蛋白质与药物的结合方式药物本身有活性基团，可采用偶联试剂与蛋白结合；若药物本身无适当活性官能团，可经化学处理使产生活性基团，然后再与蛋白结合。） 特异抗体的制备 动物：家兔 方法：抗原+福氏佐剂油包水乳剂 注射：皮下、皮内、腹腔、静脉等 时间：每隔一定时间注射一次，注射数月后可得满意的抗体 抗体的鉴定 三个方面评价 l 特异性即免疫反应的专属性，指抗原与抗体结合能力与其他类似物结合能力的比较。

21、 l 活度抗体与相应抗原的亲和力，即抗原抗体结合的牢固度，其决定免疫分析的灵敏度，表现在剂量反应曲线的斜率上，斜率大，活性高。 l 滴度以免疫反应液中抗体的稀释度表示，稀释倍数越大，滴度越高。测定不同稀释度的抗血清的结合能力，一般选择结合率为50%时的抗血清稀释度作为测定时抗体的浓度。 注意：活度与亲和力有所区别，在免疫分析中，亲和力指抗原的性质，活度指抗体的性质。 免疫分析法的分类 按标记物不同 ，分为：放射免疫；酶免疫 ；荧光免疫；化学发光免疫 根据抗原抗体结合反应平衡后，是否将结合物B与游离物F分离，分为均相免疫、非均相免疫 放射免疫分析是将放射性同位素的测量方法与免疫反应的基本原理相结

22、合的一种同位素体外检测法。非均相需分离 放射性比度即单位重量抗原所含的放射强度(curie/g)。 常用来标记抗原的放射性同位素有3H、14C 125I 131I等。 游离与结合部分的分离常用方法：层析法、吸附法、沉淀法、微孔滤膜法、双抗法、固相法。 酶免疫分析，是将抗原抗体反应与酶的高效专一催化特性相结合，用酶来标记药物的检测方法。 可将EIA分为： 均相酶免疫分析法酶标记的药物与抗体形成结合物后，酶的活性受到抑制或激活，使酶与底物的作用发生了改变，或者只有游离的酶标记物能作用底物产生信号，或者只有结合的酶标记物能作用于底物产生信号，因此，不必分离即可进行测定。 非均相酶免疫分析法标记抗原与

23、抗体形成结合物后，酶的活性不受影响，故须分离后再测定。在液相中进行，主要是指酶联免疫吸附实验，可分为竞争法、双抗体夹心法和间接法。 荧光免疫分析，以荧光物质或潜在荧光物质为标记物，当标记药物与抗体结合时，发生荧光强度改变，或在酶作用下发生荧光而被检测。 分为：底物标记荧光免疫分析、荧光偏振免疫分析、荧光淬灭免疫分析。 ：此法是以酶底物为标记物，底物本身不发生荧光，但受到相应的酶作用时能产生荧光。荧光强度与药物浓度呈正比。标记物为半乳糖苷伞形酮，水解产生伞形酮，具有强荧光性质。标记药物由底物和药物组成，当标记药物与特异性抗体结合后，使酶不能催化底物；只有游离的标记药物能被酶催化产生荧光。荧光强度

24、和待测药物浓度成正比。 第9章 光谱法 1.几种消除干扰的方法： 差示分光光度法：利用被测物在两种不同溶液中吸收光谱发生了特征性变化，而共存干扰物在该两种溶液中未引起光谱变化，测定两种溶液的吸收度差值，根据A与被测物浓度C的线性关系进行定量测定。 测定波长的选择：利用最大吸收波长。 双波长法：选择两个合适的波长，一个为测定波长人 测，另一个为参比波长人 参，测定两波长处吸收度差A= 人 测人 参，根据A与浓度C的线性关系进行定量测定。 波长的选择： 人 测被测物吸收峰附近 人 参干扰物在人测处的等吸收点，即干扰物在此两波长处A值相等，A杂=0 导数分光光度法 2.荧光法 激发光谱：激发光的波长

25、和发射荧光强度的关系曲线，最高峰的波长能使荧光物质发出最强的荧光。 发射光谱：固定激发光波长，记录荧光强度随荧光波长改变的关系曲线。 3.激发波长ex与发射波长em的选择 l 两波长距离应20-30nm，理想差距50nm。 l ex应接近被测物强吸收带。若有n个强吸收峰，宜选波长最长的峰，以减少光分解的量。 l 注意散射光Rayleigh光和Raman散射光的影响，可先测空白试剂，再选择合适波长，以避开溶剂的散射光。 溶剂选择：溶剂极性影响荧光强度，一般荧光峰的波长随溶剂解电常数增大而增大。 pH值选择：通常荧光强度因pH值不同而变化，应调节pH值以获得最大灵敏度和可靠性。 读数校准：荧光读数

26、是一个相对值，为获得准确测量，需用荧光标准物对仪器进行读数校准。 灵敏度和专属性：灵敏、专属是荧光法的优点。检测限可达ng或pg级，荧光分析适合于低浓度分析，高浓度时需注意“自熄灭现象”。 温度：一般温度， 荧光 第10章 药代动力学 1.生物利用度：制剂中药物被吸收进入体循环的速度与程度。 生物利用速度是指药物进入血液循环的快慢。可用ka或MAT表示，实际研究中常用tmax比较制剂间吸收快慢。 生物利用程度，即药物进入血液循环的多少，可通过AUC表示。因为它与药物吸收总量成正比。 2.绝对生物利用度：以静脉制剂为参比制剂获得的药物活性成分进入体内循环的相对量。 相对生物利用度：以其他非静脉途

27、径给药的制剂为参比制剂 3.生物等效性：一种药物的不同制剂在相同的实验条件下，给以相同的剂量。 Fabs=AUCTXivAUCivXT100%Frel=AUCTXRAUCRXT100%4.生物利用度和生物等效性的研究方法：采用随机交叉试验设计方法。随机是要求受试者的来源和分组具有随机性以及各组服药顺序的随机性。交叉试验则是在同一个体身上作对比的试验设计方法。 洗净期(washout period) 指两次试验周期之间的间隔时间，或交叉试验时，各次用药间隔的时间。 洗净期应保证受试药物体内消除99%以上,洗净期一般不小于7t 1/2。 给药剂量与方法 一般为该药物的临床常用剂量，最大不得超过其最

28、大安全剂量。通常供试品与参比制剂的给药剂量应一致。 采样点的确定 要求得到一条完整的药时曲线，它应包括吸收相、吸收后相和消除相。服药前应取空白血样，而后一般在药时曲线峰前部分至少取4个点，峰后部分取6个或6个以上点，总采样点不少于11点。采样时间持续到受试药物3倍t1/2 后，或血药浓度为Cmax的1/10以下。 第11章 治疗药物监测和给药方案 1.治疗药物监测是以药代动力学原理为指导，分析测定药物在血液或其它体液中的浓度，用以评价疗效或确立给药方案，使给药方案个体化。 2.TDM的理论基础 一、血药浓度与药理效应 药理作用与血药浓度之间的相关性比药理作用与剂量的相关性要好。 大多数药物，药

29、理作用的强弱和持续时间，与药物在受体部位的浓度成正比，而血液中药物浓度间接的反映了药物在受体部位的浓度。 药效与血浓之间的相关性：相同血药浓度对不同种属的动物有极为相似的药理效应。剂量与血药浓度之间相关性较差。由于存在诸多可能影响血药浓度的因素，导致剂量与血药浓度之间相关性较差。 二、有效浓度范围与目标浓度策略 有效血浓范围:指最低有效浓度与最低毒副反应浓度之间的血药浓度范围，即个体化给药的目标值。 三、影响血药浓度的因素 药物因素:药物的不同制剂 机体因素 ： l 生理因素：年龄对血药浓度有较明显的影响 。 l 病理因素：尤其肝、肾功能损害的影响。 l 遗传因素：影响药物代谢的遗传因素 ：乙

30、酰化代谢 肝脏的羟基化代谢 细胞色素P450 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏 。 l 环境因素：肝药酶诱导剂和抑制剂，联合用药的药动学相互作用等。 3.TDM在临床治疗中的作用 l 判断药物治疗的依从性 病人是否按医嘱上的剂量方案用药？ l 生物利用度的差异：不同厂家或不同批号的药品，因生物利用度差异而影响临床疗效。 l 药代动力学的差异： 以生物转化的差异最为重要。 l 药物相互作用的影响： 药酶的诱导或抑制，药物与血浆蛋白的结合被另一药置换，药物从肾小管的主动分泌被另一药抑制等等 。 4.哪些情况下需要进行TDM 1) 治疗血药浓度范围狭窄的药物，如强心苷类、锂盐等。 2) 药代动力学个体差异

31、较大的药物，如普萘洛尔 、普鲁卡因胺等。 3) 药物的中毒反应与自身疾病状态难以区别的药物，如苯妥英钠、普鲁卡因胺等。 4) 具有非线性药代动力学特征的药物，如苯妥英钠、水杨酸、茶碱等。 5) 肝肾功能不全的患者使用主要经肝代谢消除或肾排泄的药物时，胃肠道功能不良的患者口服某些药物时。 6) 合并用药产生相互作用影响疗效时。 7) 长期用药的患者依从性差，不按医嘱用药，病情需要时。 8) 各种原因引起的药效变化，如长期用药产生耐药性；诱导或抑制肝药酶活性而引起药效降低或升高；以及原因不明的药效变化。 9) 常规剂量下出现毒性反应，诊断和处理药物过量中毒，以及为医疗事故提供法律依据。 10) 当

32、患者血浆蛋白含量低时，需要测定血中游离药物浓度，如苯妥英钠。 6.常用个体化给药方法 稳态一点法 ：病人先按医生预先估计的剂量服药，并连续用药使血药浓度达稳态时，测定一次血样以调整剂量 。 第12章 转运体 1.转运体的分类：可溶性物质载体(Solute Carriers, Slc)、ATP依赖型转运体即ABC转运体(ABC Transporters)、质子/寡肽转运体(POT)。 2.转运体参与药物的吸收、分布、代谢、排泄过程，将转运体介导的药物转运称为第三相代谢。 3.鉴定P-gp底物或抑制剂的体外试验方法 ，首选双向转运试验 用极化单层细胞进行双向转运试验 (a) 体外P-gp探针底物的

33、选择条件：对P-gp转运蛋白具有选择性、 具有较低或适中的膜通透性。 常用底物：地高辛、奎尼丁、长春碱、洛哌丁胺、他林洛尔。 (b) 体外P-gp抑制剂的选择条件：对P-gp转运蛋白具有选择性； 具有较低的Ki及IC50值，IC5010M 环孢素A不仅是P-gp的强抑制剂，同时也是MRP2和OATP-C的强抑制剂 奎尼丁和维拉帕米同时是其他有机阳离子转运蛋白的抑制剂 由于抑制剂缺乏专一性，因此推荐使用多种抑制剂，以确定外排是否与P-gp有关 4.判断是否为P-gp底物 l 在评价试验药是否为P-gp底物前，先确定细胞状况是否良好 l 如果细胞对探针底物显示较差的P-gp外排活性，此系统不能用于

34、试验 l 探针底物 (positive control)的净外排的比值应与文献值相近 5.判断是否为P-gp抑制剂？ l 在评价试验药是否为P-gp底物前，先确定细胞状况是否良好 l 如果细胞对探针底物显示较差的P-gp外排活性，此系统不能用于试验 l 探针底物 (positive control)的净外排的比值应与文献值相近 l 探针底物的浓度应低于表观Km值。选用2到3种已知的强P-gp抑制剂作为阳性对照 l 一开始，可选用高浓度试验药考察其对P-gp探针的影响 体外药物代谢酶鉴定方法 1.实验选取的材料： 人组织：新鲜制备或冷冻保存的肝细胞、新鲜分离的肝切片 亚细胞肝组织：微粒体、S9、

35、细胞液或者重组酶，也与肝组织联合使用 2.实验设计：将药物和肝细胞或肝切片共孵育，然后分析孵育介质或细胞内容物。可对氧化、水解以及转移酶反应形成的代谢物直接鉴定。试验中应采用多个药物浓度和孵育时间。 3.鉴定CYP代谢酶的方法 特异性化合物或抗体作为酶抑制剂 单一的人重组酶 具有CYP酶活性的人肝微粒体 4.CYP抑制剂的体外评价方法 l 若药物将某一CYP酶抑制，则可能降低通过相同途径代谢的联用药物的清除率，可直接导致其血药浓度的升高，从而引起不良反应或使疗效增加。 l 代谢途径的抑制也可能导致合用前体药物其活性代谢物的产率减少，从而降低疗效 。 竞争性抑制作用 1。Vmax不变， 2。Km

36、随抑制剂浓度的改变而改变 非竞争性抑制机制 1.随着抑制剂浓度的变化， Vmax变化， 2. Km保持恒定 l 酶的非竞争性抑制剂的抑制活性不受底物影响，不管有没有底物，非竞争性抑制剂对酶的抑制程度都一样 l 通常认为非竞争性抑制剂和底物与酶的结合位点不同，它通过某些方式例如诱导酶活性部位的构象变化来抑制酶的活性 5.探针底物：在确定药物是否会抑制某一特定的CYP酶的体外试验中，可将药物与CYP酶的探针底物共孵育 要求：选择性 简单代谢 其它因素，如底物和代谢物的商业获得性；试验方法灵敏、快速、简便；合理的孵育时间 建议采用两种结构不同的CYP3A4/5底物来评价体外CYP3A的抑制作用； 若

37、药物在体外能抑制至少一种CYP3A底物，则应进行体内评价。 6.体外CYP抑制试验的设计考虑因素： (a) IC50值测定：底物浓度低于Km值。Ki值测定：底物和抑制剂的浓度需要覆盖一定范围 (b)微粒体蛋白浓度一般 10% (e)时间和酶浓度与产物生成量应呈线性关系 (f)任何溶剂的浓度应 1%( v/v)，最好小于0.1，因为某些溶剂会对酶产生抑制或诱导作用。在试验中，设立非溶剂对照组和溶剂对照组 (g) 使用已知的抑制剂作为阳性对照 7.预测受试药是否有潜在的药物相互作用 I/Ki比值预测药物相互作用的可能性 I代表给予最高剂量后药物在稳态水平的Cmax值 8.体外诱导试验 材料：新鲜分

38、离的肝细胞或者冷冻保存的肝细胞酶活性，用潜在诱导剂药物、阳性对照、溶剂同时处理； 也可采用永生化肝细胞系，前提是证明用阳性对照能诱导细胞系中CYP3A4及CYP1A2的活性 要求： (a)试验药物的浓度根据药物在人血浆中的预期浓度来选择：至少选用涵盖有效治疗浓度的三个浓度点进行试验，其中至少一个浓度应比平均血药浓度高一个数量级。如果没有参考资料，浓度范围至少应涵盖两个数量级 (b)肝细胞处理2-3天后，可用合适的CYP特异性探针药物进行酶活性的测定。完整的肝细胞单层和分离得到的微粒体都可用于试验 由于存在个体差异性，应至少选用三个肝供体的肝细胞进行试验 采用永生人肝细胞系进行试验时应平行三份

39、预测诱导活性的指标 (a) 药物引起酶活性的改变与阳性对照相比40%时，可判断为酶诱导剂 (b)也可选用EC50值作为指标，比较不同药物的诱导强度 (c)根据目前关于CYP诱导的细胞机制，如果诱导试验显示试验药不是CYP3A4的诱导剂，则可以判定它也不是CYP2C8、CYP2C9或CYP2C19的诱导剂 9.体外方法优点：减少体内干扰因素、提高代谢物检测灵敏度、快速简便，适合高通量筛选、动物量减少 缺点：缺少细胞内环境、缺少代谢物循环 第14章 内源性活性物质 1.内源性物质：是体内代谢中产生的活性物质及终产物,比如NH3、胺类、激素、胆色素、神经递质等都可以称为内源性物质。 2.体内存在的天

40、然性激素有三种：雌激素、孕激素和雄激素，女性体内与生殖有关的激素是雌激素和孕激素。 内源性雌激素和孕激素最主要的代表是雌二醇和黄体酮，妇女服用足够剂量的外源性孕激素，使体内维持高孕激素水平，抑制脑垂体分泌促性腺素，阻止卵巢排卵，实现避孕的目的。 女用避孕药大多由孕激素和雌激素按适当比例配伍组成。 3.吗啡是一个历史悠久而且非常有效的镇痛药，至今仍用于临床，特别是用于晚期肿瘤病人的止痛。以阿片受体为靶标，设计和人工合成了许多吗啡的类似物、简化物，其中一些显示出对阿片受体有激动作用，具镇痛作用，成瘾性比吗啡小得多，此类药物现已在临床使用，如哌替啶(度冷丁)、曲马多等。 第15章 毒物和兴奋剂检测

41、1.苯丙胺类毒品 麻黄素，从麻黄草植物中提取或合成的生物碱。 药理作用：麻黄素兴奋和肾上腺素受体而产生拟交感作用，收缩皮肤和粘膜血管、弛缓支气管平滑肌、缓慢和持久的升高血压、兴奋中枢等作用。 伪麻黄碱的血管收缩、弛缓平滑肌和升高血压作用较弱而中枢作用较强。 是制造毒品冰毒的原料。 苯丙胺，临床用于抗焦虑、治疗精神抑郁症和发作性睡眠病。 过量或反复使用将导致疲乏、头痛、中枢抑制和兴奋失调以及精神症状。 孕妇可引起胎儿心脏缺损、畸形足、兔唇和大血管异位。 具有较强的成瘾性。制造冰毒的原料。 冰毒，微溶于水，溶于乙醇、乙醚和氯仿，加热到200400时，有98的挥发。分左、右消旋光学异构体。对石蕊试纸

42、呈碱性。 盐酸甲基苯丙胺纯品为白色结晶粉末，熔点172174，溶于乙醇、氯仿和水，水溶液 值，几乎不溶于乙醚。 对中枢神经系统极强刺激作用，产生强烈生理兴奋。精神依赖性很强，一使用即可上瘾，很难戒断。大量消耗体力和降低免疫功能，严重损害心脏、大脑组织甚至致死。 氯氨酮，俗称“K粉”。 静脉麻醉药：选择性阻断痛觉传导。用于小手术、辅助麻醉。静脉或肌肉注射后很快出现意识模糊，如入梦境，但仍可睁眼，肌张力增加呈木僵状，对周围环境不再敏感，而痛觉却完全消失，意识和感觉分离。静脉注射1分钟开始起作用，能维持约10分钟常用动物麻醉药。 2.苯丙胺类毒品分析 显色法 乙醛亚硝基铁氰化钠试验 没食子酸试验 IR法 薄层层析法高效液相色谱法气相色谱法放射免疫法 3.禁用药物 刺激剂、麻醉剂、合成类固醇及2激动剂、-阻断剂、利尿剂、遮蔽剂、肽类激素