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1、蛋白质组学与肿瘤研究,1,摘要,肿瘤标志物是细胞在特定疾病状态下的分子信号,是检测、诊断、治疗、监测肿瘤和判断肿瘤预后的重要工具。如何发现新的、具有高度特异度和灵敏度的肿瘤标志物多年来一直是肿瘤研究的热点之一。蛋白质和蛋白质组学研究的快速发展给肿瘤标志物研究注入了新的活力。运用比较蛋白质组学研究揭示肿瘤发病机理，寻找肿瘤诊断和治疗的靶标，血清蛋白质组学研究寻找肿瘤相关抗原，是蛋白质组学寻找肿瘤标志物的主要路线。目前运用蛋白质组学方法已在多种肿瘤如肺癌，肝癌，胃癌，结直肠癌，膀胱癌，肾癌等中找到有差异表达的蛋白质，这些蛋白有望成为有效的肿瘤标志物。,2,蛋白质组学与肿瘤研究,一 什么是蛋白质组学
2、二 肿瘤产生的相关机理 三 蛋白质组学在肿瘤研究中的应用四 前景与展望,3,技术与平台 样品制备 蛋白质分离 蛋白质鉴定 生物信息学,4,，蛋白质组学与肿瘤研究,（一）蛋白质组学 蛋白质组（proteome）一词由Wilkins于1994年首次提出，意指一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质。它是一个在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组学（proteomics）是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分，表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律,5,蛋白质组学与肿瘤研究,技术与平
3、台（1）样品制备 通常使用蛋白质样品溶解液或细胞裂解缓冲液从细胞，组织或其他体液中尽可能完整地将蛋白质以溶解状态提取出来，并将其他杂质（DNA，糖类，脂类等）去除。LCM 3（laser capture microdissection，激光捕获微切割）技术是最近发展起来的一种提取肿瘤细胞的技术，成功地解决了组织中的细胞异质性问题，是提取肿瘤细胞最理想的方法。,6,蛋白质组学与肿瘤研究,（2）蛋白质分离：目前，蛋白质组学研究中蛋白质分离的主流技术仍然是双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoreus，2-DE），但是，以2-DE为基础的蛋白质组学技术存在固有的缺
4、陷：上样量的限制使低丰度蛋白质难以检测到，低溶解度和极大（200 kD）、极小（10 kD）和极端等电点值（pI）蛋白无法进入2-DE技术的有效分离范围内，故难以通过2-DE技术进行分析。目前多采用多维色谱技术。在蛋白质组学的定量研究方面，荧光差示电泳（differential gel electrophoresis，DIGE）技术以及同位素亲和标签技术（isotope coded-attinity tags，ICAT），可实现对蛋白质的定量分析1。,7,（3）蛋白质鉴定 蛋白质鉴定主要包括氨基酸组成分析，序列分析，肽质量指纹图分析和肽序列标签分析等。其中，肽质量指纹图（poptide mas
5、s finger print，PMF）分析是对蛋白质酶解后的多肽混合物进行质谱分析。质谱鉴定的主要原理是根据样品电离后样品离子的质量电荷比（m/z）的差异分离样品,8,（4）生物信息学：生物信息学是随着人类基因组计划、计算机技术、网络技术的发展而诞生的一门新兴学科，它是蛋白质组学研究中不可缺少的一部分。生物信息学在蛋白质组学研究中有两个重要应用：一是分析和构建双向凝胶电泳图谱，二是搜索与构建蛋白质组数据库。目前应用最普遍的数据库是NRDB和dbKST数据库。,9,（二）肿瘤产生的相关机理 中医观点：一般正常人的气升降出入，是循环畅通的。但在内、外因素影响下，致使气的功能失调，引起气的郁滞。气滞
6、日久，必然血瘀；气滞血瘀，积久成块。或由于火毒内蕴，情志化火血遇火则凝结，气血紊乱，堵塞经络，久则凝结成块。大多数癌瘤，是由于情志郁结，过于劳累，饮酒过多，或病毒侵袭。或某些特别刺激，致使生理机能反常，局部组织变形、变性。从分子水平看：肿瘤是由于DNA RNA病毒等生物因素，亚硝胺类等化学因素，X射线等物理因素引起细胞内蛋白质等的结构发生改变而引起的，特别是蛋白质的改变，因此我们研究蛋白质对于抗肿瘤特别有意义。,10,肺肿瘤,11,12,胸部肿瘤细胞 细,13,14,（三）蛋白质组学在肿瘤研究中的应用,（1）比较蛋白质组学：运用蛋白质组学研究技术，比较肿瘤组织（细胞）与其起源的正常组织（细胞）
7、或肿瘤发展不同阶段组织中蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异，可以发现与癌变相关的特异蛋白质，这些肿瘤相关的特异蛋白质不仅可为研究肿瘤发病机理提供线索，而且可作为肿瘤诊断和治疗的生物标志物7 例如将肿瘤相关基因转染细胞，制备肿瘤相关基因转基因小鼠、基因敲除小鼠或利用RNA干扰技术封闭其表达，再应用蛋白质组学技术分析相应模型蛋白质组的变化，有可能发现肿瘤相关基因所调控的蛋白质，为揭示其功能和致瘤机理提供线索,15,（2）血清蛋白质组学 从肿瘤免疫学的观点来看，肿瘤细胞是“非已细胞”，肿瘤细胞总是或多或少地表达区别于正常细胞的肿瘤抗原，因而，在患者血清中极有可能存在其相应的抗体。可分为四步
8、：,16,（1）首先采用2-DE分离肿瘤组织、癌旁正常组织的蛋白质（2）与患者或正常人血清中的某一类免疫球蛋白建立Western blot反应图谱，通过计算机分析确定差异反应的蛋白质斑点（3）采用质谱分析和生物信息学方法对平行胶（replica gel）中相应的差异蛋白质点进行鉴定，筛选出肿瘤相关抗原（4）用其他肿瘤组织和正常组织对肿瘤相关抗原的特异性进行分析,17,（3）蛋白质芯片 以蛋白质或多肽为材料，可以从微量的样品中检测成千上万个蛋白质或多肽，用于分析差异表达的蛋白质及药物靶标的筛选和鉴定。目前应用最多的是表面增强激光解吸离子化（SELDI）蛋白质芯片技术。,18,蛋白质芯片技术,应用
9、方法：首先将100 l血点在蛋白芯片上，再经过特别的生物芯片检测仪分析，就可对常见的肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、前列癌癌和子宫内膜癌等10多种癌症进行早期筛查，能极大地提高癌症早期检出的敏感性和特异性,19,蛋白质芯片技术,原理：间接法 第二抗体抗体抗原 这套检测系统是利用目前最先进的高科技生物芯片制备技术、酶联免疫、化学发光及抗原抗体结合的双抗体夹心法原理，在固相基质上包被12种肿瘤标志物的抗体，捕捉被检者血清中对应的肿瘤标志物（即抗原），结合第二抗体（标有示踪标记物），催化化学反应产生光信号并进行定量检测,20,蛋白质芯片技术,据北京、上海、广州、深圳等多家
10、大型医院的检测报告，其准确率高达80以上，该技术检测范围广，检出率高，适用于无症状人群的癌症筛查，癌症患者治疗结果的评价及复发转移的动态监测 肿瘤细胞,21,研究进展,1肺癌：肺癌是当今世界各地最常见的恶性肿瘤之一，也是我国的多发癌症之一，且发病率呈不断增长趋势。在细胞，组织以及血清中都发现有差异表达的蛋白质或肿瘤相关抗原。如在细胞水平，Jong 等9应用蛋白质组学技术分析比较人恶性上皮细胞（A549）和正常上皮细胞，发现 Peroxiredoxin I可作为一个有价值的肿瘤标记物和肺癌药物治疗的靶标。詹显全等10用双向凝胶电泳及飞行时间质谱法分析了人肺鳞癌细胞NCI-H520蛋白质组分，以及
11、人肺腺癌细胞A-549和正常细胞HBE的蛋白质组差异，结果补充到了人肺癌细胞蛋白质组数据库。,22,2肝癌：肝细胞癌是非洲、中国和东南亚国家最常见的恶性肿瘤之一。肝细胞癌的发生与HBV 和HCV 感染有关。Seow等13分析了人肝癌细胞株HCC-M的蛋白质表达图谱，并对408个点进行了质谱分析。除了一些看家蛋白外，还检测到了可能与癌变有关的蛋白，如14-3-3蛋白、膜联蛋白、抗增殖蛋白和硫氧还蛋白过氧化物酶。,23,3胃癌：Ryu 等20对11 例胃癌患者组织标本及其正常和切缘组织进行2-DE 分析，每例癌组织大约产生1 500 个蛋白质点。他们对癌和正常组织之间有明确表达差异的蛋白质点进一步
12、做MALDI-TOF质谱鉴定，结果有7种蛋白质在癌组织中过表达，包括NSP3、transgelin、prohibition、HSP27等，同时也发现阿朴脂蛋白A1、p20、核苷二磷酸异构酶A等7种蛋白质在癌组织中低表达。Sinha等21对耐热的人胃癌细胞系进行研究，发现stratfin、细胞角蛋白79、calreticulin、葡萄糖调节蛋白78、HSP（hsp27、hsx70 变异体、hsp27 变异体）在细胞系中过表达，而annexin-1、脂皮素1 变异体、启动因子5A 及其变异体等在细胞系中低表达。,24,4肾癌：意大利Sarto等25将10个肾癌组织和10个正常肾组织的蛋白质双向电泳
13、图谱进行对比分析，发现有4种蛋白质在肾癌中缺失，其中谷胱甘肽过氧化物酶两种异构体、锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）单体只出现在正常组织中，而Mn-SOD多聚体只出现在肿瘤组织中，该蛋白与线粒体氧化还原功能有关，说明线粒体氧化还原功能障碍在肾癌的发生、发展中起重要作用。通过生物信息学进一步分析发现，该蛋白质表达变化与染色体结构变化存在着相关性，认为这种蛋白可以作为肾癌的诊断标志物,25,5鼻咽癌：鼻咽癌是我国（尤其是华南地区）及东南亚常见的一种恶性肿瘤，在世界其他国家或地区较为少见。中南大学湘雅医学院肿瘤研究所与湖南师范大学生命科学院24率先采用双向凝胶电泳和质谱技术分析了人鼻咽癌细胞系HONE
14、1的总蛋白质，鉴定出10种在HONE1细胞系中表达较强的蛋白质，包括胰岛素样生长因子（ILGF），白细胞介素-14（IL-14），癌蛋白WNT-2和丝裂原激活蛋白激酶-8（MAPK-8）等,26,*最新研究*NCI和FDA的研究者们认为，一项新的技术可以帮助临床医生监测病人对分子靶向药物的反应。这项新技术就是蛋白质组学的三个新进展之一：细胞内蛋白质的研究。这项新技术本来是准备在94届美国癌症研究联合会年会上报告的，但是那次年会取消了。,27,第一次研究中，人们成功地找到了特异的蛋白质用于监测乳癌和卵巢癌病人。方法是基于肿瘤细胞中活性蛋白质浓度的改变，从而帮助大夫在治疗的早期鉴别所用的药物对病人
15、是否有效。科学家们不仅测量每种蛋白质的总量，而且测出活性蛋白质的量。在治疗前测量一次，在治疗中挑选几次测量。他们发现，治疗前，临床结局不好的乳腺癌病人通常有更多的活性蛋白，如AKT，可以促进细胞的生存。用Herceptin治疗后，AKT含量降低，促进了肿瘤细胞死亡。NCI临床蛋白质组学的指导者之一 Lance Liotta说：“用Herceptin似乎可以改变肿瘤细胞中AKT的浓度。我们或许可以通过测量接受这种治疗的病人的AKT浓度，从而鉴别阻止这条信号通路是否对这个病人有效”。研究者们希望蛋白质组学的技术可以用于监测其他肿瘤靶向药物治疗的效果,但是还需要进一步研究那些肿瘤中最适合的蛋白质。,
16、28,（四）前景与展望,（美国国家癌症研究所）NCI虽为NIH的下属单位，但其财政预算直接由国会审定，资金充沛，2005财政年度的研究预算更是达到48.7亿美元，较2004年的执行预算47.7亿美元增加约2.8%。近5年来，NCI的全职工作人员保持相对稳定，而经费由2001年的32.7亿美元升至2005年的48.7亿美元，增加约48.9%,29,前景与展望,近年来蛋白质组学技术发展迅速，已经成为后基因组时代研究的热点和主流。1986年世界上第一个蛋白质序列数据库SWISS-PROT建立至今，大量的人类正常组织和病理组织数据库纷纷建立。随着蛋白质组信息学的迅速发展，蛋白质组学技术已经发生质的飞跃
17、，但还远未完善。在肿瘤研究方面，存在着肿瘤组织中细胞种类繁多、难以获取单一的肿瘤细胞、制备纯化的肿瘤细胞蛋白质困难、肿瘤发生发展中的低丰度蛋白难以分辨等问题。此外，Celis等还发现，即使经过短暂的体外培养，肿瘤细胞的关键蛋白也会发现明显变化。这些问题都为肿瘤蛋白质组学的研究提出了新的挑战,30,随着新技术的不断产生，如激光捕获微切割（laser capture microdissection，LCM）技术，可从多种细胞混合的肿瘤组织中获取所需的特定的肿瘤细胞，避免蛋白质的异源性。此外，蛋白质芯片、虚拟细胞模型（virtual cell model，E-cell，cyber-cell）29、2D-DIGE的使用，ICAT技术的完善等都为蛋白质组学技术的完善提供了条件，使蛋白质组最终能成为人类肿瘤机制阐明和防治的最有力的武器之一。相信通过DNA（基因组）、RNA（转录子组）和蛋白质（蛋白质组）3个不同水平信息的整合，一定可以更深刻地揭示肿瘤发生的本质，从而发现临床诊断和治疗肿瘤的新的武器，为人类最终战胜这一疾病做出贡献。,31,攻破癌症 Thanks,32,
