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1、免疫实验实验安排 实验一、ELISA板包被，封闭；小鼠抗原免疫；补体结合实验 实验二、小鼠脾细胞提取及计数 实验三、流式；NO测定； 双扩；血型鉴定 实验四：ELISA；妊娠反应 实验一：ELISA板包被，封闭小鼠抗原免疫眼球取血 包被 、封闭ELISA反应板 1. 实验步骤： a. 微量加样器的使用 b. 包被ELISA 反应板 ，37孵育1小时。 c. 封闭ELISA反应板 ，37孵育0.5小时。 2. 实验目的：检测小鼠抗绵羊红细胞抗体水平 3. 试剂与器材： a. 包被稀释液 Na2CO3 1.5g；NaHCO3 2.9g 加双蒸水至1000ml b. 封闭液 小牛血清50ml；PBS
2、950ml c. 洗涤液 NaCl 8.0g；KH2PO4 0.2g；Na2HPO4.12H2O 2.9g；KCl 0.2g；Tween 20 0.5ml 加双蒸水至1000ml 4. 操作方法： 包被酶标反应板： a. 待测血清：绵羊红细胞免疫小鼠血清 b. 用pH9.6 的碳酸盐缓冲液1：200 稀释的抗原SRBC，用之包被聚乙烯塑料板。 c. 每孔加100ul， 37温箱孵育1小时 1 封闭酶标反应板 d. 弃掉包被液，加入200ul PBS洗涤3 次，每孔洗3遍，每遍1min。 e. f. 甩干后用5%小牛血清/PBS 液封闭，每孔200ul。放370.5小时。 封闭结束后，弃掉封闭液
3、，加入200ul PBS洗板3次，并在滤纸上拍干，每孔洗3遍，每遍1min。 步骤说明： 1. 酶联免疫吸附试验技术：是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。 2. ：就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。在ELISA 板上加上抗原以后，因为电荷数与板不同，所以抗原吸附板上，但
4、是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙； 3. ：就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附 原理： 4. 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性; 5. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性; 6. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果. 注意事项： 1. 量取样品时选择适当量程的加样器，
5、2. 安装相应的枪头 小鼠腹腔免疫 1. 实验动物：昆明鼠6-8周，雌性 2. 实验药品：抗原：绵羊红细胞 3. 腹腔注射：5%的SRBC注射2ml 4. 操作步骤： 2 免疫细胞的制备： 准备适量的全血细胞：SRBC 1500rpm*10min 小心吸弃上清，留红细胞沉淀 3mL生理盐水，重悬细胞沉淀 重复上述步骤，反复洗3次。 第三次离心后： 3mL生理盐水，重悬细胞沉淀：制备好的SRBC. 腹腔注射： 左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部。 右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿刺，针头刺入皮肤后进针3mm左右。 使注射针头与皮肤呈45角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔
6、，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后阻力消失，有落空感。 固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液或尿液后即可注射。 注射量为2ml，标记小鼠。 5. 注意事项：免疫之前排空注射器中的空气； SRBC使用之前要混匀；. 进针后的落空感。 小鼠眼球取血 1. 实验目的：小鼠腹腔抗原免疫后，小鼠体内产生了抗体，抗体主要存在于血清内。眼球取血主要目的为收集血清。 2. 实验药品：麻醉用药：4%水合氯醛； 3. 实验步骤： a. 小鼠麻醉麻醉用药：4%水合氯醛；用量：每只小鼠0.4ml，腹腔注射 b. 眼球取血： 1、抓取小鼠，使眼球突出 2、用眼科深入眼球深部，带着结缔组织，慢速夹去眼球，用1.5m
7、l微量离心管接住流出的血液，每次采血量0.5-1ml 3、实验台上静置2h 4、离心10000rpm，10min，收集血清，-20保存 c. 把取完眼球血的小鼠泡在装有70%酒精的烧杯中，接续 d. 将眼球血离心10000rpm，10-15min， e. 使用1000L加样器收集血清 3 实验二：补体结合试验 1. 实验试剂：2% sRBC；溶血素；补体；生理盐水 2. 实验器材：小试管、微量加样器、水浴箱 3. 实验步骤： a. 标记3个清洁、干燥的试管 b. 加样 c. 水浴，37，孵育10m 4. 注意事项： a. 挑选干燥、洁净是试管。若有水的试管会导致红细胞不等渗溶血。 b. 水浴箱
8、不可关闭水浴箱的盖子。水浴箱的盖子上的水若调入试管中，会造成反应体系不等渗，进而导致红细胞因为渗透压的差异而破裂溶血。 5. 实验结果：1号管中试剂变澄清，2.3号试管均浑浊 实验三：小鼠脾细胞提取及计数 1. 实验原理：脾脏是人类最大的免疫器官，捕获血源性抗原，储存血液。是动物体内最大的淋巴器官。深居于左侧肋弓之后，颜色暗红、质地柔软、呈内侧向内凹陷的扁椭圆形或条索状等。脾为表面有被膜覆盖的实体性器官。脾细胞主要成分：淋巴细胞，是执行免疫功能的重要细胞。为进一步了解和检测淋巴细胞的数量和功能，还需要制备脾细胞悬液。 2. 实验试剂与器材：SRBC免疫一周的小鼠； PBS液作用是等渗、平衡渗透
9、压、维持离子强度和PH； 70%酒精作用是消毒 红细胞裂解液2ml冷NH4Cl 动物解剖器械平镊和齿镊、5ml注射器、平皿、1.5ml微量离心管、15ml离心管、吸管、盖玻片。离心机，细胞计数板，显微镜 3. 实验步骤： a. 取脾：将眼球取血后的小鼠颈椎脱位法处死； 70%酒精皮毛全部浸湿3-5分钟，右侧卧位； 左手持镊提起皮肤，右手持剪刀于左侧肋骨最低点与髋关节间做一小切口 ；双手持镊子与切口垂直方向钝性分离皮肤，暴露腹膜； 4 左手持镊提起腹膜右手持剪刀于腹膜做一小切口，双手持镊子与切口垂直方向钝性分离腹膜，充分暴露视野，于左侧肋缘下可见暗红色条索状脾脏； 持轻轻夹住脾脏，尽可能分离结缔
10、组织和系膜； 将取下的脾脏放入装有5mlPBS液的平皿中。 b. 脾细胞提取： 方法 优点 冲洗法 制备的细胞数比较少，细胞比较分散；能够保持细胞的完整性，细胞不易破损 缺点 不能保证细胞的完整性 研磨法 省时，便于大量操作 平镊轻轻夹住脾，用5毫升注射器吸取5mlPBS液，刺入脾脏冲洗脾细胞； 拔掉针头用注射器吸取平皿中PBS液反复冲洗2-4次，直至脾脏由暗红色变为白色； 把所获得的细胞悬液收集到15毫升离心管内，加PBS液至10ml； c. 目的 获得脾细胞 三次离心 操作 收集离心管配平，1500rpm离心10min。 去上清 裂解红细胞 使用吸管吸取2ml冷NH4Cl裂解RBC。细胞后
11、放置约5min。加PBS液至10ml；1500r/min再离心5min，去上清 洗涤细胞 加PBS液5ml洗涤，1500r/min离心10min去上清 。悬浮细胞于1ml的PBS液中。 d. 弃上清，向离心管中加入1ml PBS液，充分混匀，得混匀液 e. 计数液100倍稀释：先在EP管里加入990微升PBS液，从混匀液中吸取10微升加入到1.5ml微量离心管中涮一下枪头，反复抽吸几次，充分混匀。 f. 显微镜计数：10物镜找到细胞层和计数室；40物镜找到白细胞计数区域。原则是从左到右S形计数，数上不数下，数左不数右 实验四：抗原抗体反应 1. 实验原理： a. 概念：体内外发生的高度特异性结
12、合反应，其结构基础为抗原表位与抗体超变区抗原结合位点的结构互补。 b. 特点：特异性；非共价键结合；比例要适当 c. 影响抗原-抗体反应的因素： 电解质：0.85%氯化钠溶液； 温度：37； 酸碱度：pH6-8。抗原抗体复合物可在一定条件下解离，而免疫学特性不变。 5 d. 凝集反应：在颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原中加入相应的抗体，在电解质存在的条件下出现凝集物的现象，称凝集反应。参与反应的抗原如细菌，细胞等，称凝集原，抗体称为凝集素。包括直接凝集反应和间接凝集反应。本次实验为玻片反应。 e. 凝集反应分类：直接凝集反应：试管法和玻片法 间接凝集反应 间接凝集抑制试验 协同凝集反应 抗
13、球蛋白试验 玻片法简便，快速，为定性试验，可做为半定量检测前的筛查试验，因该反应在玻片上进行而被命名玻片法 ，主要用于临床的血型鉴定，菌种鉴定 2. 实验器材：人外周血；抗A、抗B标准血清；玻片，采血针，棉签，酒精等 3. 实验步骤： a. 准备玻片：取清洁载物玻片一张，于玻片左侧和右侧各加一滴抗A及抗B标准血清 b. 采血：用无菌采血针刺破指尖或耳垂，用灭菌玻片的四个角分别取血，加入含有抗A及抗B标准血清的液体中 c. 反应：经12 分钟后用肉眼观察结果，出现红细胞凝集颗粒者即为阳性反应；仍为均匀混悬液者为阴性反应。 实验五：双向免疫扩散实验 1. 实验原理：在含有电解质的凝胶中，可溶性抗原
14、和相应抗体辐射扩散，形成浓度梯度，在比例适合处形成肉眼可见的白色沉淀线。一条沉淀线为一组特异性抗原抗体复合物。 2. 结果分析： a. 沉淀线数量：对抗原抗体复合物只形成一条沉淀线； b. 沉淀线形状：沉淀线对于相应的抗原抗体是不可以通透的，对无关的抗原抗体是可以通透的；沉淀线的外形与反应物的分子量有关，通常趋向分子量较大的一方 c. 沉淀线位置：与反应物的相对浓度有关，通常靠近浓度小的一方 3. 实验目的：检测病人血清中的甲胎蛋白 4. 实验试剂与器材：待测病人血清：待测1，待测2；阳性对照血清；抗AFP诊断血清；1.5食盐琼脂；琼脂板、打孔器，微量加样器，湿盒 5. 实验步骤： a. 第一
15、步：铺板将4ml琼脂倒入琼脂板中。 b. 第二步：打孔打7个小孔,约7mm间距。 c. 第三步：加样每空加样约1015l。 d. 第四步：孵育放入37温箱孵育约24小时。 6 6. 注意事项：倒胶要快速；打孔无裂缝；孔勿靠近琼脂边缘；加样不溢出；加样无气泡；清洗加样器 P 1 A2 P 两条沉淀线相会后融合在一起，说明样品孔与阳性对照孔为相同成分。 2 1 7mm 7. 结果分析：阳性对照孔和样品孔分别与SRBC小孔之间出现白色沉淀线。实验六：小鼠巨噬细胞NO的测定 1. 实验试剂与材料：NaNO2标准品；1640培养液；待测样品； Griess试剂：使用之前两液等量混合；微量加样器、枪头、板
16、条。 2. 实验原理： a. 巨噬细胞功能：强大的吞噬杀伤病原微生物的能力；重要的抗原提呈细胞，可摄取、加工处理及提呈抗原，激发适应性免疫应答；活化的巨噬细胞分泌大量细胞因子、补体成分及NO等，调控免疫应答。 b. 诱导型NO合成酶系统为巨噬细胞活化后所产生的反应性氮中间物。iNOS属胞浆酶，在还原型辅酶II或四氢生物蝶呤存在下，可催化L-精氨酸与氧分子反应，生成胍氨酸和NO。NO与吞噬细胞氧化酶所产生的过氧化氢或过氧化物酶结合，在体内酸性环境中产生可杀伤细菌的过亚硝酸盐基，其在酸性环境中与Griess试剂中的磺胺和N-奈基乙二胺双氯化物进行重氮、偶氮反应，产生鲜艳橙红色产物。因此通过Grie
17、ss法检测NO的水平来反映巨噬细胞的活化程度。 3. 实验步骤： a. 于孔28中每孔加入100l 1640培养液 b. 于孔1中加入200l NaNO2标准品 c. 从孔1中吸出100l 加入2中，吹吸3次，再从2中吸出100l 加入3中，吹吸3次，再从3中吸出100l 加入4中，吹吸3次，以此类推，直至第7孔，混匀后吸取100l 弃掉。 7 d. 于9和10中加入待测1，11和12中加入待测2，每孔100l e. Griess试剂，每孔100l，室温10分钟，观测结果 实验七：小鼠外周血T细胞亚群的鉴定流式细胞术 1. 实验原理： a. 流式细胞术：利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态
18、中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 b. 流式细胞仪特点：特异性好；灵敏度高；多参数分析；快速采集分析；客观性；流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上 c. 流式细胞仪工作原理：将待测标本制备成单细胞悬液,经荧光标记抗体染色后由气压装置送入流动室。流动室由样品管和鞘液管组成,鞘液管充满流动的鞘液,鞘液流与样品流压力不等,当两者压力差达到一定程度时,鞘液裹挟着样品流迫使细胞有序地排列成单列,逐个进入激光聚焦区经激光束激发,产生散射光和荧光信号；通过一些波长选择通透性滤光片,即可将不同波长的散射光
19、和荧光信号区分开来。散射光和荧光信号接收后转换成数字信号送计算机处理,可在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。 d. 流式细胞仪应用： 分选细胞；分析细胞大小和内部复杂程度 ；检测细胞表面表型: 抗细胞表面抗原抗体, MHC 四聚体等；透化细胞后细胞内蛋白染色；追踪细胞和 增殖 (CFSE)；分析细胞内离子浓度；分析氧化还原 (redox)电位；分析细胞周期 (用结合DNA的染料)；凋亡分析 (annexin V, TUNEL etc)；细胞因子分泌实验 (以及其后的分离)；多重蛋白分析实验 e. f. 设立阴性对照管的意义：去除自发荧光，调节电压 设立单标管的意义：不同荧光
20、之间会有叠加，必需通过调节补偿来校对。 g. 设立同种型对照管的意义：用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色 h. 同种型对照：是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同种型对照是真正意思上的阴性对照。 2. 实验试剂与器材： a. 昆明鼠 b. 肝素 c. 同种型对照抗体：CD3-FITC；CD4-PE；CD8-PerCP d. 荧光抗体：CD3-FITC；CD4-PE；CD8-PerCP e. 红细胞裂解液：0.17 mol NH4Cl，PBS液 8 f. 眼科镊、微量加样器、微量离心管、枪头、流式管、离心机等。 3. 实验步骤： a. 小鼠眼球取血后加肝素抗凝 b. 将血液分装到2支不同试管中，1号管加同种型对照的三个抗体，每个10ul; 2号管加三种荧光抗体各10ul。加荧光抗体后，室温静置5min c. 每管加红细胞裂解液1ml ，室温孵育5分钟 d. 每管加2ml PBS，起到终止裂解，清洗作用 e. 离心1500rpm, 6min f. 弃上清，加500ulPBS4. 混匀，上样，待检 9
