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1、1,第十六章,药品质量控制中的新方法与新技术,2,一、高分辨气相色谱法,第一节 色谱分析新方法及其应用,high resolution gas chromatography,（HRGC）,（一）色谱柱类型,3,填充柱,毛细管柱,开管型,填充型,涂壁型 固定液涂布在管内壁,载体型 固定液涂布在管内壁 的一层载体上,固定液涂布在管内填充的载体表面上,将载体、吸附剂等装入玻璃管后，拉制成毛细管,4,熔融石英开管柱（fused silica open tubular column,FSOT）,0.25mm0.25m12m、25m、50m,增加柱容量 0.35mm0.5m,提高柱效 0.15mm0.1m
2、,（开管型毛细管柱）,5,优点,柱效高重复性好分离速度快,6,进样方式,1、分流进样,7,2、不分流进样,样品注入后，在汽化室气化，在开口端冷却，以液体形式收集，然后快速加热色谱柱进行再进样。Grob偶然发现，色谱峰没有过分展宽。利用了溶剂效应。溶剂在柱头富集，是靠近溶剂峰出来的组分峰成为尖峰。适用于痕量分析，对宽沸程样品也能获得满意结果。,8,3、柱头进样,这是一种针对分流和不分流进样的缺点而设计的进样方式。其特点：1.必须使用外径为0.17-0.23mm的细针，开管柱内径必须大约0.32mm；2.不能通过隔垫进样；3.缓慢进样，以免倒流；4.对热不稳定、稀的和宽沸程的样品比较理想；5.能给
3、出定量结果。,9,二、手性分离色谱,构型命名法,L型,D型,（CSC）,chiral separation chromatography,10,R型,S型,(Rectus),(Sinister),11,一、手性药物的现状,手性药物（579）,药物（1992）,天然和半合成药物（556）,合成药物（1436）,非手性药物（857）,单一异构体（73）,外消旋体（506）,手性药物（547）,非手性药物（9）,单一异构体（537）,外消旋体（10）,12,不少光学异构体的生物活性不同而引起不同的治疗效果,加拿大健康保护部门1993年11月公布了有关手性药物开发的简要指南,欧共体1994年5月发布了
4、有关手性药物开发的最终指南,美国FDA（美国食品药物管理局）1992年5月将“FDA开发新立体异构体药物的政策报告”递交联邦注册处备案,13,立体异构体,包括一个或一个以上手性中心,其单个对映体之间可互成镜像,几何异构体,非对映异构体,14,优对映体（强效体）,劣对映体（低效体）,具有最高活性或亲和性对映异构体,强效非选择性-受体阻滞剂噻吗洛尔S(-)体为优对映体，活性为R(+)体的8090倍,噻吗洛尔R(+)体,15,二、手性药物对映体的药效学差异,（一）仅一种异构体有治疗作用,抗高血压 S(-)-甲基多巴,（三）药理作用与强度相似,抗过敏 异丙嗪,（二）药理作用不同,抗疟药(+)奎宁,抗过
5、敏(-)奎尼丁,16,（四）药理作用相似，反应强度不同,氯胺酮 S(+)体较R(-)体镇痛作用强34倍,（五）药理作用相近，毒理作用不同,沙利度胺 S(-)体和R(+)体镇静作用相近，但S(-)体有胚胎毒及致畸作用,17,三、手性药物对映体的药动学差异,头孢氨苄 口服后仅R(+)体被吸收,（一）吸收,主动吸收有立体选择性,（二）代谢,维拉帕米 S(-)体较R(+)体清除率高 10倍,18,华法令 S(-)体与白蛋白的结合率较R(+)高。S(-)体体外抗凝活性是R(+)的68倍，但体内仅为25倍,（三）蛋白结合,19,四、研究手性药物的意义,（一）手性药物质量控制,（二）体内手性药物的分离分析,
6、（三）研制新型手性药物,20,五、手性药物HPLC拆分法,21,以现代HPLC技术为基础，向手性药物中引入不对称中心进行拆分，以达到分离目的,手性药物HPLC拆分法原理,22,（一）间接法,手性衍生化拆分法（chiral derivatization reagent,CDR）,（二）直接法,手性固定相拆分法（chiral stationary phase,CSP）,手性流动相拆分法（chiral mobile phase,CMP）,23,手性衍生化拆分法（CDR）特点,可采用常规固定相衍生化过程可同时纯化样品需光学纯手性试剂衍生化反应较繁琐费时,24,萘衍生物类衍生化试剂的应用,25,手性衍生
7、化拆分4对麻黄碱对映异构体,衍生化试剂(+)-1-(9-芴基)乙基氯甲酸酯,(+)-FLEC,26,+,27,仪器与设备,HPLC Hewlett-Packard 1090型HPLC系统，配有三元梯度泵（带柱温箱）,自动进样系统（带衍生功能）,二极管阵列检测器（DAD）,Pascal工作站,pH计（Beckmen）,28,色谱条件,色谱柱 HP ODS柱，2004.6mm 5m,流动相 A、纯水；B、乙腈,柱温 40,流速程序 0.0min流速1.5ml/min 10.0min流速1.5ml/min 20.0min流速2.0ml/min,梯度条件 0.0min B：35%30.0min B：7
8、5%,29,自动进样的衍生程序,样品位置 0号：水 1号：硼酸盐缓冲液（pH7.4）2号：(+)-FLEC(+)-1-(9-芴基)乙基氯甲酸酯 3号6号：麻黄碱样品,30,衍生程序,1-draw 0.0l from vial 0（水）2-draw 3.0l from vial 1（硼酸盐缓冲液）3-draw 0.0l from vial 04-draw 1.0l from vial 2(+)-FLEC5-draw 0.0l from vial 06-draw 1.0l from vial sample7-draw 0.0l from vial 0,31,8-draw 2.0l from via
9、l 19-draw 0.0l from vial 010-inject,32,麻黄碱对映异构体与(+)FLEC衍生化反应,33,手性固定相拆分法（CSP）原理,利用手性固定相与对映体消旋物相互作用，其中一个与手性固定相生成不稳定的短暂的对映体复合物，使两种异构体在色谱柱上的保留时间不同，从而得到分离,34,手性固定相拆分法（CSP）特点,直接、快速、有效、简便容量大，适用于制备不需对样品衍生化价格昂贵,35,手性固定相的分类,1、根据拆分过程中固定相与对映体 之间的相互作用分类,吸附型、模拟酶移植型、电荷转移型、配体交换型,36,2、根据固定相的材料分类,蛋白质类、氨基酸类、纤维素类、环糊精类
10、、冠醚类、聚酰胺类、聚氨酯类,37,3、Pirkle型手性固定相,Pirkle实验室研制出来的固定相,4、蛋白质类手性固定相,将一个单分子层的手性有机分子通过一定间隔基连接在硅胶上,38,手性卵粘蛋白柱拆分盐酸硫氮卓酮的合成原料(a)与中间体(b),固定相 手性卵粘蛋白柱(ES-OVM)（卵粘蛋白中的糖蛋白通过共价键的 形式结合在硅胶上）,39,手性流动相拆分法（CMP）原理,将手性试剂添加到流动相中，利用手性试剂与药物消旋体中各对映体稳定常数的不同，以及药物与结合物在固定相上分配的差异，实现对映体的分离,40,手性流动相拆分法（CMP）特点,可采用常规固定相不需对样品衍生化手性添加物本身可流
11、出，也可更换添加物的可变范围较宽,41,常用手性添加剂,配基交换型手性添加剂Chiral ligand-exchange complexes（CLEC）,环糊精添加剂Cyclodextrins（CD）,手性离子对添加剂Chiral ion pair complex（CIPC）,42,配基交换型手性添加剂（CLEC）,原理 光学活性氨基酸与金属离子鳌 合后，与药物消旋体形成配位 络合物，在柱上完成拆分,多为光学活性氨基酸或其衍生物,43,固定相 RP-HPLC金属离子 Cu（）,常用配基交换型手性添加剂及其色谱条件,44,环糊精添加剂（CD）,原理 环糊精可提供手性空穴，如果 待分析样品分子大小
12、与空穴相 符合，则可形成环糊精包合物,是由吡喃葡萄糖组成的花瓣形环状低聚糖：、类型,45,手性离子对添加剂（CIPC）,原理 对映体与手性离子对试剂形成 非手性离子对，与对映体因在 流动相和固定相间分配行为不 同而得到分离,46,三、高效毛细管电泳分析法,（HPCE）,high performance capillary electrophoresis,以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配系数的不同而实现分离的一类液相分离技术,47,电泳,电渗,淌度,带电组分在电场作用下，以不同速度向所带电荷相反方向迁移的现象,管内溶液在外力电场作用下整体朝一个方向移动的现象
13、是推动流体前进的驱动力,单位电场强度下的迁移速度,电泳淌度,电渗淌度,48,1937年瑞典科学家Tiselius将蛋白质混合物置装有缓冲液的管子中，当他在管子两端加电场时，发现样品组分根据其电荷和体积以一定方向和速度移动，并第一次成功地从人血清中分离出白蛋白及1、2、和-球蛋白,难以克服由两端高电压引起的焦耳热效应，及温度梯度、黏度梯度、速度梯度，故无法加快分离分析速度,49,1967年Hjerten提出在高电场、直径3mm的毛细管中作自由溶液的区带电泳,1981年Jorjenson和Lukacs提出使用75m内径100cm的玻璃毛细管,1984年Terabe发展了胶束电动毛细管色谱,1985
14、年Hjerten提出了毛细管等电聚焦,1987年Cohen和Karger发表了毛细管凝胶电泳的研究成果,50,1988年以后，由于高效毛细管电泳商品仪器的问世及高灵敏度柱上检测器的发展，HPCE研究在世界范围蓬勃开展，促进了毛细管电泳技术和理论的迅猛发展,51,毛细管电泳与经典电泳的根本区别,HPCE是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的一种快速、高效的液相分离技术,电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，以引入高电场强度，改善分离质量,52,毛细管电泳装置示意图,高压电源,缓冲液/样品,缓冲液,53,电渗的产生,石英毛细管-SiOHSiO-,54,电渗速度的径向分布几乎是均匀的，不会直接引起样品
15、组分区带扩散,55,液体在柱内壁上的速度为零，中心速度为平均速度的2倍，直接引起样品组分区带扩散,56,HPCE法与HPLC法比较,理论板数,分离速度,进样量,溶剂,几十万/m,30min,150nl,几不消耗,几万/m,几十min,10l,几百ml,低消耗,微量,高速,高效,57,HPCE的不足1、方法不如HPLC成熟2、在柱检测、光路长度短3、灵敏度和线性范围不如HPLC,58,一、原理,v=v eo+v ep=(eo+ep)E v 运动速度 E 电场强度 v eo 电渗速度 v ep 电泳速度eo 电渗淌度 ep 电泳淌度,59,60,（二）主要分离模式,1、毛细管区带电泳（CZE）2、
16、胶束电动毛细管色谱（MECC）3、毛细管凝胶电泳（CGE）4、毛细管等电聚焦（CIEF）,61,62,1、毛细管区带电泳（CZE）毛细管中仅有缓冲液，根据组分迁移时间或淌度不同而得到分离,63,毛细管区带电泳特点1、简单、快速、分辨率高，应用范 围广2、从原理上讲，适用于所有具有不 同淌度的带电粒子的分离，包括 分子量为几十万的生物大分子,64,2、胶束电动毛细管色谱（MECC）在缓冲液中加入离子型表面 活性剂胶束，使电中性组分可按 其在胶束相和水相的分配系数不 同而进行分离,65,胶束电动毛细管色谱特点1、是唯一能同时分离中性物质和离子 型物质的分离模式2、采用手性分配相时可分离手性药物,6
17、6,3、毛细管凝胶电泳（CGE）凝胶的网络结构对溶质具有分 子筛的作用，使溶质按分子大小逐一分离,(+),(-),67,毛细管凝胶电泳特点1、可分离质荷比不随分子大小而变 的大分子如DNA或SDS-蛋白质复 合物2、可用于测定多肽和蛋白质分子量3、可加入不同添加剂而改变分离的 选择性,68,4、毛细管等电聚焦（CIEF）采用两性电解质混合溶液作为载体，pI 值大于其pH值的溶质和其带正电，向负极移动，pI值小于其pH值的溶质和其带负电，向正极移动，根据蛋白质等电点的不同达到分离,69,A,A,A,A,A,A,B,B,B,B,B,B,C,C,C,C,D,D,D,D,D,E,E,E,E,E,F,F
18、,AA,AA,BB,BB,CC,CC,DD,DD,EE,EE,FF,FF,(+),(-),GG,GG,毛细管等电聚焦,70,毛细管区带电泳（CZE）分离测定青霉素发酵液中青霉素及其相关物质的含量,分析条件毛细管 87cm75m操作电压 30KV(+)(-)缓冲液 20mmol/L磷酸盐（pH7.5）检测波长 214nm柱温 25,71,青霉素发酵液的高效毛细管电泳图1.青霉素G钠 2.未知 3.对羟基苯乙酸4.邻羟基苯乙酸 5.苯乙酸,72,胶束电动毛细管色谱（MECC）分离测定黄芩中6种黄酮类成份,分析条件毛细管 40cm50m操作电压 20KV(+)(-)缓冲液 50mmol/L磷酸二氢钠
19、-12.5mmol/L 硼砂(pH8.0)：乙醇：-环糊精(7：1：2)检测波长 275nm，0.02aufs柱温 20,73,黄芩中6种黄酮类成分的胶束电动毛细管色谱1.汉黄芩甙 2.黄芩素 3.黄芩甙 4.千层子素5.汉黄芩素 6.内标水杨酸 7.白杨素,74,第二节 光谱分析新方法及其应用,（A 法）,75,原理,两份相同浓度的供试液在不同的pH介质中或经适当化学反应后，待测物的特征光谱发生改变，干扰物的光谱不变，故这两份溶液的A只与待测物浓度有关,76,优点,可不经分离直接测定混合物,条件,1、待测组分在不同条件下 A值应有明显改变,2、干扰组分在不同条件下 A值应无明显改变,77,非那根止咳糖浆中盐酸异丙嗪的测定,盐酸异丙嗪、愈创木酚磺酸钾、氯化铵等,max=337nm,78,79,含对羟基苯甲酸及其酯的合剂中对羟基苯甲酸的测定,对羟基苯甲酸,尼泊金酯,0.1mol/LHCl,pH5.9,80,
