《农杆菌电击感受态的制备,转化及验证.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《农杆菌电击感受态的制备,转化及验证.docx（3页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、农杆菌电击感受态的制备,转化及验证农杆菌电击感受态的制备，转化及验证 1. 制备农杆菌电转感受态 (1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28C, 220rpm震荡培养过夜。 (2)将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28C, 220rpm震荡3-4小时，至OD560=0.5左右。 (3) 5000rpm离心5分钟，去上清。 (4) 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min. (5) 4C, 5000rpm离心5分钟，去上清。 (6 加入30mL10%甘油重悬浮菌体， 4
2、C, 5000rpm离心5分钟， (7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/管)备用。 2 农杆菌感受态的电转化 I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴 30分钟。 (2)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。 (3)马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28C, 150rpm轻摇4-6小时。 (4)收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培养基平板上， 28 培养2-3天。其实和大肠杆菌电转化差不多，只不过培养温度是28度，摇的时间长一些，还
3、有就是链霉素和利福平两种抗生素要加上，目的是防止根癌脓杆菌自 带质粒的丢失，不过具体要加哪些抗生素还得看你是那种根癌脓杆菌非常感谢我用的不是电转化 是把 茎和叶浸在农杆菌液里30秒.想知道为什么不是把菌液直接滴在土里?可以采用注射法导入农杆菌 还有就是把植株取出放入侵染液中 用真空渗透法导入 感受态制备及转化 方案二 1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101 2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线，抗生素浓度为：50g/ml。28培养。 3、农杆菌感受态细胞的制备： 1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28振荡培养至OD600 =0.5。
4、 2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min； 3）5000rpm离心30s，弃去上清液； 4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min； 5）5000rpm离心30s，弃去上清液； 6）每管用100l 20mMCaCl2悬浮，用于转化； 制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70保存。使用时从一70取出，置冰上融化后使用。 4、DNA直接转化农杆菌： 1）50l农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.11g，之后冰浴30 min； 2）放入液氮中5min，然后立即放入37水浴锅中水浴5min； 3）取出离心管，加入0.5mlLB，28、220rpm振荡培养35hr； 4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28条件下倒置培养。2天左右菌落可见。 ，然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定
