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1、凝胶色谱柱清洗方案反相硅胶键合相色谱柱的清洗 反相硅胶键合相一般包括 C18 、 C8 、 C4 、苯基等，当用二元混合溶剂进行等强度洗脱时。为移去污染物，可用 20 个体积的强洗脱溶剂，如甲醇、乙腈或四氢呋喃来冲洗柱子。如果流动相中含缓冲盐溶液，为防止有机溶剂清晰造成的盐析出，阻塞管路，应首先用 20 个柱体积的不含缓冲盐的水 - 有机相溶剂冲洗色谱柱，然后再用强洗脱溶剂清洗柱子。 如果用强洗脱溶剂仍不能驱除污染物，可以使用更强的溶剂或混合溶剂来洗脱。当需用一系列的有机溶剂清洗色谱柱时，应逐渐增加它们的洗脱强度，并确保溶剂之间的混溶性。对典型的反相硅胶柱，用于洗涤无缓冲盐的体系，推荐使用以下
2、有机溶剂清洗系统：100 甲醇 100 乙腈 75 乙腈 +25 异丙醇 100 异丙醇 100 四氢呋喃清洗后，按相反的顺序冲洗色谱柱，以返回到原始的流动相。如果使用者怀疑色谱柱被严重的污染或阻塞，可将二甲基亚砜与水或二甲基甲酰胺与水，以各自 50 的比例混合，并以低于 0.5mL/min 的流速通过色谱柱。 由于污染物聚集在色谱柱头，逆向冲洗会缩短污染物在柱中迁移的距离；又因为色谱柱皆在高于操作压力下填充的，通常逆向液流不会扰动色谱柱床。但如果色谱柱顶端过滤筛板的孔径大于柱底部过滤筛板的孔径，则固定相的微小粒子会在逆向冲洗过程通过筛板流出柱，从而会在柱中产生新的死空间引起柱床松动。因此在逆
3、向冲洗前，应先确认柱管两端过滤筛板的孔径一致。 除盐：对普通反相 C18 键合相柱，为除去柱中含有的缓冲盐类或水溶性物质时，不应使用纯水冲洗。因为 C18 键合相像一条长链将硅胶黏结，当有有机溶剂存在时，其表面被流动相润湿， C18 长链完全展开，像海水中的海藻一样。当纯水或缓冲溶液通过时， C18 键合相不能被浸润，键合相表面会塌陷，从而将溶剂、样品分子或无机盐分子包合。此时仅用纯水无法将包合物洗脱出，应使用含 5 有机溶剂的水溶液冲洗，以清除无机盐或水溶性物质。 蛋白污染：如果需从硅胶键合固定相清洗蛋白质残留物，必须使用和前述不同的程序。如果生物材料血浆或血清样品注入色谱柱，在大多数情况下
4、，纯有机溶剂 ( 如乙腈或甲醇 ) 并不能溶解肽和蛋白质，用它们清洗色谱柱是无效的。然而，有时使用有机溶剂与缓冲物、酸或离子对试剂的混合物却是有效的。 清洗反相柱中的蛋白质类物质，可使用表 1 溶剂系统。 表 1 从 HPLC 反相柱中清洗蛋白质类物质使用的清洗溶剂系统 溶剂 乙酸 三氟乙酸 0.1% 三氟乙酸-正丙醇 三乙胺-正丙醇 尿素或胍的水溶液 NaCl 、 Na3PO4 、 Na2SO4 水溶液 二甲基亚砜 - 水或二甲基甲酰胺 水 组成 1% 水溶液 1% 水溶液 40:60 40:60 5-8mol/l(PH=6-8) 0.5-1.0mol/l 水 50:50 金属污染：有时清洗
5、硅胶反相固定相需使用特殊的技术，如在早期硅胶键合相生产中，使用高金属氧化物含量的硅胶，金属离子会吸附在键合相表面，此时可使用 0.05mol/ EDTA 冲洗，将金属离子螯合，再用纯水将可溶性螯合物洗掉。 清洗溶液 TSK-SW&SWXL系列色谱柱 1. PH较低、浓度较高的盐溶液； 2. 添加水溶性有机物的极性缓冲液； 3. SDS、尿素或胍的缓冲溶液。注意：这些试剂很难被去除。它们需要使用20-40个柱体积的20% ACN进行冲洗。因此，只有当先前的清洗方法无效时才选择使用本方法。 TSK色谱柱的再水化 TSK-GEL液相色谱柱的脱水现象，可能是因为使用不当或长期放置保存过程中造成的。有些
6、TSK-GEL玻璃色谱柱中由于没有气密密封圈，这种情况下色谱柱会随时间而易发生干燥现象。对于其他的所有种类色谱柱如不锈钢或玻璃柱等，如果柱栓未拧紧或者使用过程中空气意外进入到色谱柱中，均可能发生柱子干燥的情况。很容易就可以辨认到玻璃色谱柱出现的脱水现象，因为可以很容易地看到干燥的填充物与柱壁分离的现象。我们推荐采用下列步骤，以消除色谱柱的脱水现象： 1. 按照相反的流动方向将色谱柱连接到液相系统上； 2. 不要将色谱柱与检测器相连； 3. 以推荐最大流速的一半流速，使用滤过的20%乙醇超纯水溶液进行色谱柱的过柱；注意：反相色谱柱需要使用60%的乙醇。 4. 继续重复上述程序，直到您确信色谱柱已经再水化处理完毕。再水化处理可能需要几个小时的时间，这取决于色谱柱的尺寸大小； 5. 按照正确的流动方向将色谱柱连接到液相系统上； 6. 如果有机物不是正常流动相的一部分的话，要使用3个柱体积的超纯水冲洗色谱柱以去除有机物； 7. 使用上样缓冲液进行柱平衡； 8. 使用QC测试方法评价柱子的性能，以确保色谱柱能够正常使用。
