分子生物学笔记完全.docx

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1、分子生物学笔记完全分子生物学笔记 第一章 基因的结构 第一节 基因和基因组 一、基因(gene) 是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列 一个典型的真核基因包括 编码序列外显子(exon) 插入外显子之间的非编码序列内合子(intron) 5-端和3-端非翻译区(UTR) 调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。 二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和， 基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。 人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全

2、部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划 基因组学,结构基因组学和功能基因组学。 蛋白质组和蛋白质组学 第二节 真核生物基因组 一、真核生物基因组的特点： ， 真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中 真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(23)， 三、基因家族(gene family) 一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因可能由某一共同祖先基因(ancestral gene)经重复(duplication)和突变产生。 基因家族的特点： 基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene clust

3、er)或串联重复基因(tandemly repeated genes)，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因； 有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因 (Pseudogene)a1表示与a1相似的假基因 四、超基因家族(Supergene family ，Superfamily) 由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同 第四节 细菌和病毒基因组 一、细菌基因组的特点。 1功能相关的几个结构基因往往串联在起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构， 2结构基因中没有内含子，也无重叠现象。 3细

4、菌DNA大部分为编码序列。 二、病毒基因组的特点 1每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA； 2病毒核酸大小差别很大，3X103一3X106bp； 3除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。 4大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成 5真核病毒基因有内含子，而噬菌体基因中无内含子 6有重叠基因 第五节 染色质和染色体 (二)组蛋白(histone)：一类小的带有丰富正电荷胞浆 胞浆内Ca2+的调节一通过(质膜和钙库膜上的)钙离子通道(进入)和钙泵(出)， 钙通道开放的条件： 质膜或钙库膜去极化(可兴奋细胞)； 成IP3介导钙库膜上钙通道开

5、放(任何细胞) 钙泵激活线粒体钙泵的作用 Ca2+功能：与钙调蛋白(calmodulin, CaM)结合形成Ca2+CaM复合物： 激活腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶，激活Ca2+CaM依赖蛋白激酶 钙通道阻断剂及其临床应用。 五、一氧化氮(NO) NO合成酶催化L-精氨酸生成NO和胍氨酸 NO合成酶(NOS)分类：神经元型(nNOS) 内皮细胞型(ecNOS) 诱导型 蛋白质磷酸酯酶(Protein phosphatase，PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯键水解而去磷酸化。 细胞内任何一种蛋白质的磷酸化状态是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的两种相反酶活性之间的平衡决定的。 蛋白质可逆磷酸化的调节在信号转

6、导过程中有重要作用，是细胞生命活动的调控中心。 一、信号转导过程中的蛋白激酶 一)丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(SerThr PK) 是一大类特异地催化蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化的激酶家族，参与多种信号转导过程。 1、蛋白激酶A所组成。 PKC有多种亚型(12种) PKC可激活： 受体，如EGFR，胰岛素受体，细胞因子受体等。 细胞骨架蛋白如Map，Tau 8 膜蛋白，如Na+-H+交换蛋白，Ca2+-ATP酶等 核蛋白转录因子，起始因子等， 信号转导物如鸟苷酸环化酶，Raf-1等 3、Ca2+钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Cam-PK) Cam-PKII是一种多功能的蛋白激酶 4。cGMP依赖的蛋白

7、激酶(PKG) 功能：调节胞内钙离子 5，DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK) 调节：结合游离DNA片段后被激活， 底物：核内DNA结合蛋白和转录因子，如SPl，FosJun，Myc和P53， 作用：参与DNA修复和重组, 通过激活TF调节基因表达; 参与细胞周期的关卡机制(Checkpoint). 6丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase， MAPK) 调节：MAPK激酶-MAPKK。 下游底物：核内转录因子如Myc，Jun，Ets及其它胞内蛋白 (二)酪氨酸蛋白激酶 膜受体的分类： G蛋白耦联受体家族 又称为七次胯膜受体家族，特点是具有七段跨

8、膜的螺旋结构，本身无酶活性，胞浆侧肽链上有磷酸化位点，受体功能受磷酸化调节。成员；肾上腺素受体、多巴受体、视紫红蛋白等。 酪氨酸激酶受体家族 受体本身胞浆侧有蛋白酪氨酸激酶活性，并且胞浆侧肽链上有自身磷酸化位点，配基结合后受体形成二聚体，二聚体中每个亚基可以磷酸化对应的另一亚基，从而启动信号转导。 这类受体主要包括多数生长因子受体(如IGF，EGF，PDGF，NGF，SCF，HGF等生长因子的受体)，除胰岛素受体外，这类受体均由一条肽链组成 (三)细胞因子受体家族 这类受体本身无TPK活性，但其胞浆侧近膜部分有非受体酪氨酸蛋白激酶的结合位点，在配基与受体结合后，受体发生二聚化或寡聚化，并激活J

9、ak族蛋白酪氨酸激酶 此类受体包括细胞因子受体以及生长激素、促乳素等受体 细胞因子(cytokine)：是淋巴细胞和造血细胞产生的一大类对细胞生长和分化有调节作用的蛋白因子。包括干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、白血病抑制因子、抑癌素M等 (但IL-8R为G蛋白藕联受体) (四)离子通道受体 与配基结合后构成离子通道，主要存在于神经突触，如乙酰胆碱(ACH)，5-HT受体等。 二、G蛋白介导的信号转导 。 G蛋白藕联受体的信号转导途径由三部分组成： 细胞膜受体；G蛋白效应物(effector)，其中G蛋白将受体与效应物藕联 G-蛋白(G-protein)是一种鸟苷酸结合蛋白，是由、和三个亚

10、基组成的异三聚体， 多，和亚基总是紧密结合在一起作为一个功能单位G G亚基可分为Gs,Go,Gi,Gq等，其活性可被霍乱毒素或百日咳毒素修饰。 G-蛋白介导的信号转导的机制：G-蛋白循环。 G-pr的效应物：离子通道、腺苷酸环化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2等 三、RAS-MAPK信号转导途径 1、途径中的信号分子 Ras：具鸟苷酸结合活性的一种胞浆蛋白 Ras活性与其结合的鸟苷酸有关。 鸟苷酸交换因子 RasGDP RasGTP (失活) GTP酶激活蛋白 接头蛋白：生长因子受体结合蛋白Grb2，通过其SH2结构域与Tyr被磷酸化的受体结合，同时通过其SH3域与具有pro富集区的SOS结合，并通过

11、SOS活化Ras蛋白 10 2、Ras-MAPK途径： 生长因子生长因子受体(具酪氨酸激酶活性)含有SH2结构域的接头蛋白(如Grb2)鸟苷酸交换因子SOSRas-GTPRaflMAPKKMAPK转录因子调节基因表达。 3Ras-MAPK途径的调节 Ras-MAPK途径中信号转导分子的突变(如Ras)和表达量的改变 其他信号转导途径的影响 cAMP-PKA：抑制Raf-1； PKC：活化Rafl， 四、Jak-stat途径： STAT：信号转导物与转录激活剂 至少6种，分子量84-113KD，含一个SH2结构域(羧端)，一个SH3样结构域，并合有DNA结合域，Stat的激活依赖通过磷酸化形成二

12、聚体 Jak-Stat途径： 细胞因子受体(二聚体化)JakStatStat二聚体(活化)易位至核，影响转录 第六章 细胞周期及其调节 细胞增殖(cell proliferation)与细胞生长分裂周期 第一节 细胞周期 一、细胞周期(cell cycle)：指亲代细胞分裂结束到子代细胞分裂结束所经历的过程，这个过程所需的时间称为细胞周期时间。 细胞周期由G1、S、G2和M期组成(G1、S和G2期又合称为分裂间期)。 G1(Gap1)期：DNA合成前期(复制前期)，从上次有丝分裂完成到DNA复制之前的阶段; S期：DNA复制期; G2期：合成后期，从DNA复制完成至有丝分裂开始; M期：有丝分

13、裂(Mitosis)期，包括核分裂和胞质分裂 M期结束后形成两个新的子细胞。 注：不同细胞的细胞周期时间不同，一般S+G2+M期较恒定，而G1期变化较大，因而它决定了细胞周期时间的长短； G1期细胞有三种可能的趋向：1)进入S期(即进入细胞周期)2)处于静止期即Co期(在一定条件下可重新进入增殖周期)，3)分化、衰老、凋亡。 二、细胞周期中各时相的主要生化事件 细胞周期中每期都有其特殊功能，其中S期的DNA复制和M期细胞核的有丝分裂是细胞周期中2个最关键的过程： 1、G1期：为DNA复制作准备，G1早期合成各种RNA、结构蛋白和酶等，细胞通过一个限制点(restriction point，R点

14、)后在G1后期合成DNA复制有关的蛋白和酶。 在开始合成DNA之前有一个关卡(checkpoint)，检查染色体DNA是否有损伤，如有则先要进行修复。 2、S期：DNA(包栝端粒)的复制及组蛋白合成、核小体装配S期后每一染色体复制成2个染色单体 SG2期关卡：检查DNA复制是否完成 3、G2期：为有丝分裂作准备有RNA和非组蛋白合成。 4、M期：染色体浓缩一仿锤体形成染色体分离并移向细胞两端染色体解聚，形成两个新核胞质分裂。 第二节 周期素依赖性蛋白激晦与细胞周期调节 周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs) 通过使特异底物磷酸化调节细胞周期进行，其活

15、性依赖与周期素(cyclin)结合形成复合物。 一、周期素-周期素依赖性蛋白激酶 周期素家族和周期素依赖蛋白激酶(CDK)家族 细胞周期的不同时相表达不同cyc-CDK，这些cyc-CDK复合物在各不同的细胞周期过渡点起作用 11 1、G1期cyc-CDK G1期表达的周期素为周期素C、D, 程序性细胞死亡 生理性细胞死亡。 第一节 细胞凋亡概论 一、凋亡与坏死apoptosis vs. necrosis） 凋亡是一个受细胞主动调节的自身消化过程，凋亡细胞的特征形态学改变使其可被其它细胞吞噬而不泄露胞质内容物，不会引起炎症反应。 坏死是由于物理损伤、缺血或细菌毒素等引起的破坏性细胞死亡过程，细

16、胞内容物的释放导致局部炎症反应。 二、凋亡的生理功能 1、 维持组织稳态平衡,通过干细胞分裂产生新细胞的同时，选择性地除去那些损伤的或老的或多余的细胞。 2、 清除不需要的免疫细胞。 3、 神经元发育 4、 个体发育 三、凋亡细胞的形态学和生化特征 1、 细胞皱缩 2、 质膜出泡 3、 染色质浓缩 4、 DNA裂解：核小体DNA ladder 5、 磷脂酰丝氨酸由质膜内侧翻转至外侧 6、 凋亡小体的释放 第二节 凋亡的分子机制 一、细胞表面死亡受体 细胞死亡受体家族的成员是一类跨膜蛋白，它们均含有一个与配基结合的胞外结构域；一个跨膜域和一个转导胞外信号进入胞内的胞内结构域(死亡结构域)。这此受

17、体同它们的配基结合后被激活并导致细胞凋亡。 二、Bcl-2家族 对B细胞淋巴瘤的研究发现bcl-2是一种抗凋亡基因，进一步研究证明它与ced-9基因同源。 1、 由于8：14染色体易位所致的bcl-2过度表达抑制肿瘤细胞凋亡。 2、 与Bcl-2功能相似的有Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, and A1等，构成一个大的蛋白家族。 3、 这些蛋白表达于线粒体、内质网和核被膜的外膜，Bcl-2及其高度同源物Bcl-xl 保护线粒体膜的完整性。 Bax-促进凋亡的Bcl-2家族成员： 1、 与Bcl-2结合的蛋白，包括Bax、Bak、Bik 、Bid、 Bim和HRK。 2、 当在细胞中过

18、度表达时促进凋亡，其杀细胞活性可被Bcl-2类蛋白拮抗。 3、 抗凋亡蛋白和促进凋亡的蛋白如Bcl-2和Bax间的比率决定细胞对凋亡信号的敏感性。 4、 Bax可被 P53上调，这是DNA损伤时P53诱导细胞死亡的一种方式。 5、 这些蛋白通常存在于其它胞内隔室如胞浆中，在凋亡时移动进入线粒体。 三、Caspase 蛋白酶-实施凋亡的蛋白酶 1、 这是一族半胱氨酸催化的在天冬氨酸处裂解底物的蛋白酶 2、所有Caspase先以无活性的酶原的形式合成，其激活过程包括：二聚体化caspase自身序列裂解成小亚其和大亚基除去prodomain。 3、最早发现的 caspase 为IL-1转化酶 (IC

19、E=caspase-1) 它将 pro-IL-1 前体裂解成其活性形式。 ICE 基因转染导致细胞凋亡。此过程可被一种牛痘病毒蛋白CrmA抑制。 CrmA抑制所有caspase。 4、已知该家族成员超过12个，虽然其中某些 caspase参与白细胞介素的成熟，但大多数作用是激活凋亡 。通过在特异性caspase裂解位点(e.g. DEV D)处裂解靶蛋白，而使蛋白激活或失活，从而影响凋亡。 例如： 13 a. DFF -DNA fragmentation factor- cleavage of an inhibitory subunit activates this nuclease whic

20、h cuts the DNA into a distinct ladder-likepattern and for chromatin to condense. b. PARP -Poly-ADP ribose polymerase, a DNA repair enzyme inactivated by caspases c. nuclear lamin - causes nucleus to lose its structural integrity after cleavage d. cytoskeletal proteins - cleavage causes membrane bleb

21、bing 5、杀伤 T-淋巴细胞可释放颗粒酶于靶细胞上而诱导凋亡： granzymes 裂解和激活 caspase诱导凋亡 6、现正研究能完全阻断凋亡的caspases抑制剂， 看它们是否能保护中风、心梗和器官移植中细胞免于因缺血诱导的凋亡 四、 Caspases的激活 死亡受体被其配基激活 1、TNF 受体与称为TRADD的蛋白结合，后者再结合 FADD； Fas直接与 FADD结合。 2、 FADD结合caspase-8 (又称为 FLICE),它含有死亡结构域同时又具蛋白酶催化活性 3、 活化的caspase-8激活凋亡途径.； 4、 .触发激活的关键是受体的寡聚化。在 Fas系统中 F

22、asL与 Fas 的相互作用导致 Fas 受体形成三聚体,从而激活凋亡。 5、FasL 也是一个单一跨膜蛋白。FasL 既可通过与之相互作用杀死相邻细胞，也可激活细胞自身的Fas而自杀。 Apaf1- caspase活化蛋白 1、Caspase-8裂解 Bid 使其 C-端域易位至线粒体中。 2、Bid及其它 Bcl2家族促凋亡蛋白的作用导致线粒体释放细胞色素C。. 3、Bcl2抑制cytochrome c释放。 4、Cytochrome c 在胞浆中与Apaf-1结合。Apaf-1/cytochrome c经需能的寡聚化形成大的蛋白复合物 (Apoptosome)，后者聚集procaspas

23、e-9 5、 procaspase-9经自身裂解而活化。 6、Caspase-9裂解caspase-3和其它caspases，激活凋亡的效应器期 effector phase ）,从而使细胞结构被破坏。 第八章 基因克隆 基因克隆或分子克隆,又称为重组技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。 克隆一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。 一个完整的基因克隆过程包括以下步骤： 、 获得待克隆的DNA片段； 、 目

24、的基因与载体在体外连接； 、 重组DNA分子导入宿主细胞； 、 筛选、鉴定阳性重组子； 、 重组子的扩增与或表达。 第一节 重组DNA中常用的工具酶 包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等， 一、限制性内切酶的定义、命名和分类 限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。 限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制修饰系统。 分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第类。 14 限制性核酸内切酶的命名。 二、限制性核酸内切酶的作用特点 1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称； 2、切割DNA均产生含5-磷酸和3-羟基的末端； 3、 错位切割产生具有5-或3-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端