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1、主讲教师 李孝坤,项目四：城镇污水监测任务7 粪大肠菌群的测定,任务7 粪大肠菌群的测定,1.1 方法名称与适用范围,水质 粪大肠菌群的测定多管发酵法 HJ/T 347-2007,方 法名 称,适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定,适 用范 围,1.2 方法原理,粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便，在44.5温度下能生长并发酵乳酸产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。用提高培养温度的方法，造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。多管发酵法是以最可能数（most probable number）
2、，简称MPN来表示试验结果的。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。,任务7 粪大肠菌群的测定,2.1 培养基和试剂,(1),单倍乳糖蛋白胨培养基,成分：蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳 糖 5g 氯化钠 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL 蒸馏水 1000mL制法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节pH 为7.27.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115灭菌20min，贮存于暗处备用。,(2),三倍乳糖蛋白胨培养基,按上述配方比例三倍（除蒸馏水外
3、），配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。,注：本试验测定所使用的培养基为配制的乳糖蛋白胨培养基，也可使用成品的大肠菌群发酵培养基，如：乳糖胆盐发酵培养基，等。,(3),EC 培养液,成分：胰胨 20g 乳糖 5g 胆盐三号 1.5g 磷酸氢二钾（K2HPO4）4g 磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。置高压蒸汽灭菌器中，115灭菌20min。灭菌后pH 应为6.9。,高压灭菌锅,生化培养箱,2.2 仪器和设备,任务7 粪大肠菌群的测定,3.1 培养基制备及灭菌,（1）水样接种量的确定 将水样充分混
4、匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表1。,表1 接种水量参考表由于本次测定的是污水处理厂的出水水样，所以选取的浓度梯度为10-3、10-4、10-5。,（2）乳糖蛋白胨培养基分装,杜氏小管,杜氏小管,杜氏小管,杜氏小管,10 mL 3倍,10 mL 1倍,10 mL 1倍,10 mL 1倍,如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白
5、胨培养液5mL；如接种量为1mL或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中。,（3）准备其他要灭菌的物品,（4）灭菌:115 OC，20 min,水源水,90 ml无菌水,9 ml无菌水,移液管,3.2 水样制备及稀释,（1）采样瓶（2）采集污水处理厂出水口的水样,（3）水样的稀释,1 mL,10 mL,90 mL无菌水,9 mL无菌水,原液,10-1,10-2,1 mL,1 mL,9 mL无菌水,10-3,9 mL无菌水,10-4,9 mL无菌水,10-5,1 mL,10-5,杜氏小管,杜氏小管,杜氏小管,10ml 3倍,10 ml 1倍,10 ml 1倍,1 ml,1 m
6、l,培养条件：37、24h,3.3 粪大肠菌群的初发酵,10-4,1 ml,10-3,生化培养箱,1.培养基变为黄色，杜氏管中有气泡（阳性）,2.培养基仍为紫色，杜氏管中没有气泡（阴性）,3.4 观察粪大肠菌群的初发酵结果,表2.1 记录初发酵阳性管数,轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用接种环将培养物转接到EC培养液中。在44.50.5下培养24h2h。培养后立即观察，发酵管产气则证实为菌群阳性。,3.5 粪大肠菌群的复发酵试验,表2.2 记录复发酵阳性管数,任务7 粪大肠菌群的测定,根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表3 中查得每升水样中的粪大肠菌群。接种5份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，查表3 求得MPN 指数，MPN 值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群。如果接种的水样不是10mL、1mL 和0.1mL，而是较低的或较高的三个浓度的水样量，也可查表3 求得MPN 指数，再经下式计算成每100mL 的MPN 值。,4.1 粪大肠菌群测定的结果分析与报告,表3 最可能（MPN）表,作 业,1.为什么说提高温度培养出的大肠菌群更能代表水质受粪便污染的情况？2.根据试验情况，报告每升水中含粪大肠菌群的数目。,谢谢！,
