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1、原代细胞的培养法原代细胞的培养法 组织块培养法 组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，57天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。 其培养方法如下： 按照前述方法取材，将组织剪成
2、或切成1mm大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。 将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm0.5cm，一般在25mL培养瓶可接种2030小块为宜，小块放置后，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37温箱内。 培养24小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养35天时可换
3、液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 原代细胞培养-2 2、消化培养法 该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。 某些特殊类型细胞，如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤，将在有关章节中叙述。 3、悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 4、器官培养 器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系
4、、并能存活，器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境23的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求。 1、器官培养的特殊的要求 需要特殊的培养条件 因器官离体培养，其营养和氧气仅靠自然渗透来供给，因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死，其厚度或直径不宜超过1mm. 器官内部细胞需要有足够的氧气渗入 常采用以下两种方法： a. 将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。 b. 提高培养基中的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持5% CO2,以维持pH. 2、器官培养的方法 将不锈钢网做成的支架，放置于培养皿中，高度为1/2皿高，使其表面铺上0.5mm孔径的滤膜。 将培养基加入平皿中，使培养液刚刚接触到滤膜，但不要使滤膜浮起。 将要培养的器官组织平放在滤膜上，一般厚度不要超过200m,水平面积不超过10mm,如为肝、肾不能大于1mm. 将培养物置于CO2培养箱内，并加注氧气，调整氧分压达90%,培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。 上述器官培养13周后可用于实验和检测。 22
