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1、生物显微镜,显微镜的种类,单式显微镜,放大镜,复式显微镜,普通光学显微镜研究显微镜（与数码技术结合）红外显微镜荧光显微镜离心显微镜偏光显微镜相差显微镜干涉差显微镜倒置显微镜暗视场显微镜体视显微镜（解剖镜）,电子显微镜,常用植物制片技术,植物制片的分类按保存时间分按制作方法分,活体观察切片法非切片法,临时制片永久制片,切片法,徒手切片法石蜡切片法冰冻切片法植物显微化学（组织化学）制片,涂片法压片法离析法整体装片法,非切片法,一、徒手切片法,1、准备显微镜、镊子、解剖针、刀片、培养皿、载玻片、盖玻片、绸布或纱布、染料2.切片23 cm的材料一段，用左手大拇指或食指夹住材料，上方突出于手指23 mm
2、，不宜太高，否则材料容易摇动。右手以拇指和食指拿稳刀片即可切片。切片时为了避免材料干枯，应使材料的切面和刀刃上保持有水，呈湿润状态。每切23片后，移入盛有清水的培养皿中。如果切面倾斜，应立即纠正。过于柔软的器官，例如幼嫩的叶片，需用胡萝卜根或马铃薯块茎等作为支持物，将要切的材料夹于其中，然后进行切片。选择比较完整的切片进行染色和封片。,一、徒手切片法,3.染色染色的方法很多，视材料的要求不同，选用不同的染料。4.封片注意尽量防止产生气泡，封片完毕后，用纱布擦去多余水，即可在显微镜下观察。,二、石蜡切片法,石蜡切片技术是显微技术上最重要最常用的一种方法，优点在于（1）应用范围广，几乎适用于所有的
3、植物材料；（2）能切成极薄而且连续的切片，较清楚地显现细胞、组织的细微结构；（3）切片可以长期保存，便于以后观察比较。因此，这项技术自18 世纪创建以来，在植物细胞、组织研究史上发挥了重要作用，并且在今后仍将作为一项常规技术而发挥作用。石蜡切片技术的整个过程较复杂，可大体概括为：取材固定脱水透明浸蜡包埋修块切片粘片脱蜡复水 染色 脱水透明 封片,根据观察目的不同，选用合适的新鲜材料，要求“精而小”,不在于“大而多”，应注意：取材的代表性。材料新鲜，大小在0.51厘米，有利于固定液的透入。刀片锐利，立即固定，如不能即刻固定，须尽量防止变干、损伤。详细记录日期、采集地点、标本名称、取材部位、固定液
4、种类。,1、取 材,2、固 定用一定的化学溶液（固定剂）在尽可能保持细胞生活结构的情况下迅速杀死组织的过程。作用：防止组织溶解及腐败；使细胞内各种成分沉淀保存下来，保持它原有的生活结构；使细胞内的成分产生不同的折射率，造成光学上的差异，便于观察；使细胞硬化不容易变形，利于固定以后的处理。,酒精甲醛醋酸（简称F.A.A）固定液适用范围：是生物制片中最常用的一种良好固定液和保存液。一般植物的器官和组织均可用此液来固定，称为“标准固定液”或“万能固定液”。配法:50%或70%酒精 90毫升 冰醋酸 5毫升 甲醛 5毫升 材料在此固定液中，固定24小时即可进行脱水步骤。同时它又是良好的保存液（4），材
5、料在此液中放置很久也无妨碍，甚至保存数年仍可制作切片。,常用固定液：,卡诺氏固定液适用范围：根尖、花药、子房配法1：95%乙醇3份+冰醋酸1份配法2：95%乙醇6份+冰醋酸1份+氯仿3份（固定花药，观察减数分裂）固定24h，转入70%乙醇中，于4冰箱保存备用。（若在短时间内压片观察，可保存在固定液中）,、脱 水,材料从固定液中取出，需先冲洗。F.A.A固定液，用50%或70%酒精冲洗。卡诺氏固定液，用95 85 70酒精冲洗。,脱水的步骤：（若采用整体染色法，先染色2-3天，再脱水）梯度酒精：50%、70%、85%、95%、100%。事先配好，随时取用。从低到高，逐级脱水。100%酒精需2次。
6、各级酒精停留的时间，依材料的性质、大小、而定。根尖、茎尖、每级30分钟1小时，草本植物组织为2小时，木本根、茎24小时，大的或较坚硬的材料，各级停留的时间还要延长些。在操作时，低浓度酒精可稍快些，到高浓度酒精时则不能过快，这样才能脱净水分。从95%进入纯酒精后，时间不能过长，否则材料变得硬脆。为了彻底将水分脱净，需要更换两次纯酒精，每次30分钟1小时。此时，瓶子上的塞子也应更换干燥的，以免有水分渗入。,4、透 明,二甲苯是应用较广的一种透明剂，透明力强，但缺点是材料在其中停留过久，容易发生收缩、变脆、变硬，常用氯仿（三氯甲烷）代替二甲苯。将氯仿配制成下列不同的浓度,2/3乙醇+1/3氯仿、1/
7、2乙醇+1/2氯仿、1/3乙醇+2/3氯仿、纯氯仿，事先配好，随时取用。为了避免组织收缩，材料经无水乙醇脱水后，不能直接移入纯氯仿中，而必须经过以上几个级度逐渐置换，才能进入纯氯仿中。材料在每级中停留时间，视组织块的大小而定，一般30分钟2小时，在纯氯仿中应更换2次，再用纯二甲苯更换2次（20分钟1次）。,5、浸 蜡,（1）将石蜡配成下列浓度：2/3二甲苯+1/3石蜡、1/2二甲苯+1/2石蜡、1/3二甲苯+2/3石蜡、纯石蜡，事先配好，随时取用。（2）材料放入2/3二甲苯+1/3石蜡中，将其放入3640的温箱中，时间2小时。（3）材料放入1/2二甲苯+1/2石蜡中，温度控制在4555，时间2
8、小时。（4）材料放入1/3二甲苯+2/3石蜡中，温度控制在5060，时间2小时。（5）材料放入纯石蜡1、纯石蜡2中，温度控制在5060，时间各2小时。浸蜡应在恒温箱中进行,恒温箱的温度要适宜，太高，会使材料收缩，太低，石蜡会冻结而不能透入组织。,6、包 埋,把透足石蜡的材料包埋在石蜡里成为一定的形状以便切片。在60的温箱中，换两次已溶解的纯蜡，每次约2h。包埋之前，先准备好包埋用具，一般需要镊子、酒精灯、火柴、一盆冷水及包埋用的纸盒，包埋时将融化的石蜡倒入纸盒中，迅速用烧热的镊子把材料放入并按需要的切面和一定的间隔排列整齐，然后平放入冷水中，使其快速凝固。包埋好的材料（石蜡块），可长期存放在4
9、冰箱中，备切片用。,7、修块与固着,将包埋好的材料切割成小块，每个小块包含一个材料。然后按需要的切面将蜡块切成梯形，切面在梯形的上部（注意上部矩形的对边平行）。用烧热的蜡铲将梯形的底部固定在木块上。,8、切 片,把包埋好的材料块用轮转式切片机切成连续的蜡带。切片时，将材料夹在切片机的固定位置上，调整材料切面与切片刀口平行，根据观察的要求调节好所需要的厚度（5-12m），转动切片机进行切片。切片过程中往往会出现各种问题，需要分析原因，及时纠正。（刀口锋利、刀片角度5一8、切片厚度5-12m）,9、粘片、展片、烤片,在预先洗净并干燥的载玻片上涂上一小滴粘贴剂（用量绝不可多），用洗净的手指反复涂匀，
10、然后加12滴3福尔马林或蒸馏水，用镊子轻轻将蜡片放在液面上，将此载玻片放在45左右的温台上，至蜡片受热慢慢伸直展平为止，用解剖针调整蜡片在载玻片上的位置，吸去多余水分，置入30温箱中烘干，时间约需24h。粘贴剂的配法：明胶12 g石碳酸（苯酚）2g蒸馏水100ml甘油15ml。先将蒸馏水加温至3040，慢慢加入明胶，待全部溶解后，再加入2g苯酚和15ml甘油，搅拌至全溶为止，然后用纱布过滤，滤液贮于瓶中备用。,10、染色封片,常用的染料有：番 红：植物组织学常用染料，碱性，常用于与固绿、亮绿对染，染色效果：木化细胞壁红色，角化细胞壁粉红色，栓化细胞壁黄褐色，染色体、核仁、中心体红色。固 绿：酸
11、性染料，可将细胞质和纤维素壁染成绿色。苏木精：用于幼嫩组织的染色（花药、子房、根尖），细胞核染成蓝色。,10、染色封片,染色方法视材料不同而选择。下面以植物制片中最常用的番红与固绿对染的方法为例，说明从脱蜡、染色至最后封藏的全部制片程序（均在染缸中进行）。（若采用整体染色法，直接脱蜡、透明、封片）（1）脱蜡：取已干燥好的载玻片放入二甲苯中脱蜡，约10min。（2）过渡：转到1/2二甲苯和1/2纯酒精的混合液中过渡约5min。（3）复水：脱去蜡的切片依次浸入1009585705030酒精中各12min，最后浸入蒸馏水。（4）番红染色：置0.51番红水液中染色224h。（5）冲洗：用自来水洗去多余
12、的染液。,（6）脱水：依次用30、50和70的酒精处理约30min。（7）固绿复染：用0.1固绿的95酒精溶液复染1040s。（8）继续脱水：用95酒精和100纯酒精两次彻底脱水，每次3060s。（9）透明：用纯酒精和二甲苯各半的混合液处理5min，再用纯二甲苯浸5min，使材料完全透明。（10）封片：加一滴加拿大树胶或优帕胶在材料上，盖上盖玻片，然后在3035恒温箱中烘干。,三、冰冻切片法,冰冻切片具有快速、简便、易操作等特点，且有利于进行如免疫定位和原位杂交的研究。冰冻切片技术在动物和人体的研究中已广泛应用。但由于植物细胞结构的特殊性，在植物的研究中难以推广。与动物细胞相比，植物细胞有细胞
13、壁和大液泡，含水量远大于相同体积的动物细胞，因此，较动物样品更容易在低温冷冻过程中形成冰晶，进而损伤植物细胞的细微结构。此外，冷冻后的植物样品比动物样品硬度大，难以切片和保持植物组织结构的完整性。,四、涂片法,适用于花粉和花粉母细胞等疏松组织。1.取材 如需要观察花粉母细胞减数分裂全过程，就必须采集幼嫩的呈绿色的花药较为适宜（浅绿色而透明者太嫩，黄绿色或黄色者则已过时）。一般于清晨67时和下午45时取材，植物种类不同，有差异。2.固定 卡诺氏固定液，24h后，经95和85酒精浸洗，再转入70酒精中保存在4的冰箱中。,3.染色与涂布 取固定好的材料转入50酒精，经蒸馏水清洗后，取出一个花药置清洁
14、的载玻片上，加一小滴改良苯酚品红染色液，用刀片切去花药的一端，用小镊子夹着花药，将其切面放在载玻片上涂抹；或用刀片在花药中部横断为二，再用解剖针从花药的两端向中部断开处压挤，使花粉母细胞散出，并涂布成一薄层（注意去掉药壁的残渣），再滴一滴45醋酸使之软化与分色；盖上盖玻片，用橡皮头轻压盖玻片，使花粉母细胞均匀散开即可观察。,五、压片法,细胞学研究中常用的方法，如根尖、茎尖和幼叶等。步骤：取材预处理固定解离染色压片镜检1.取材：根尖或茎尖，长度为23m。2.预处理：使细胞分裂停留在有丝分裂的中期，并使染色体缩短变粗。8-羟基喹琳、对二氯苯、秋水仙碱、低温（冰水混合物）预处理的时间24h左右，但不
15、同植物有差异,3.固定：卡诺氏固定液，24h后，经95和85酒精清洗，再转入70酒精中保存在4的冰箱中。4.解离：材料在50酒精浸泡5min，再入蒸馏水洗涤5min后，转入lmol/L的盐酸溶液中，60恒温水浴510min（材料不同有差异），时间太短，细胞不易分离，时间过长，则染色体染色浅或不着色。5.染色：改良苯酚品红、席夫试剂（孚尔根染色）6.压片：只保留分生区，除去根尖的其余部分，使细胞分散并压平。7.镜检,六、离析法,在观察植物器官内不同组织的细胞特征时，切片方法往往不能得到单个细胞的立体形态，因此常采用离析的方法获得分散的细胞。离析法的原理是用一些化学药品配制离析液把细胞壁中的中层物
16、质（果胶质）溶解，使细胞分离散开，便于观察。铬酸-硝酸离析液：铬酸、硝酸等量混合 离析木质化组织，如导管、管胞、纤维盐酸-酒精离析液：浓盐酸、95%酒精等量混合 离析薄壁细胞,七、整体装片法,适用于微小或扁平的材料，例如丝状或叶状的藻类、菌类、蕨类的原叶体、孢子囊、纤小的苔藓植物，以及被子植物的表皮、花粉粒、幼胚等幼小的器官。细胞层次少，不需经过切片，可直接观察。,八、植物显微化学（组织化学）制片,植物显微化学（组织化学）是应用化学反应或染色与化学反应相结合的方法，将组织或细胞内的某些化学成分在组织切片内予以显示。用于研究和测定植物的器官、组织及细胞中内含物的存在、化学性质、含量和分布。制片方法同石蜡切片，关键是要寻找被检测物质的特殊染料。,组织化学方法,Black-lipid(脂类)Red-polysaccharideBlue-protein(蛋白质),(多糖),
