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1、2023/3/12,1,疟原虫血片制作及染色技术,胡乐群湖北省疾病预防控制中心,血片制作所需设备,载玻片 具有磨砂面，且规格是玻片宽度乘长度在25.2*75.2mm，厚度1mm1.2mm为好。推玻片 有专用的。但现在一般选择边缘光滑整齐的载玻片替代推玻片。采血针 使用一次性的采血针。玻片盒 木制/塑料均可以。75%酒精棉球 用于采血部位的消毒。记号笔/B2铅笔 用于载玻片上编写号码。Whatman(沃特曼)903号；将滤纸切成10*2cm大小的纸片，以口径为1.2cm的大孔管，在滤纸上压出两个圆形印迹备用。,2023/3/12,3,载玻片的清洗,载玻片 用以涂制血膜的载玻片，必须清洁无油迹。有
2、油迹的载玻片涂制的厚血膜容易脱落，薄血膜涂不均匀。新玻片处理 应浸于有液态洗涤剂清水中1020分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干后用干净柔软的棉巾擦亮备用。也可以95%的乙醇浸泡510分钟，再用纱布擦干擦亮备用。旧玻片处理 用过的玻片浸泡洗涤剂溶液中12天或者浸泡于煮沸好的5%肥皂水中12小时，逐个擦去玻片上的旧血膜痕迹，用清水漂洗干净擦干擦亮。洗净载玻片处理 每1020张用白纸包好或者装原玻片盒里再放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。,2023/3/12,4,取血部位及方法,取血部位及方法 取血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。先用75%酒精棉
3、球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位12毫米深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。,2023/3/12,5,采血时间,取血时机 现症病人一般可随时取血，疟疾普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环状体期；发作后数小时，环状体发育到滋养体期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断疟疾的有利时机；3648小时，可检出裂殖体；发作一、二次后，配子体出现较多。恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小时内取血，初发患者退热后常查不到疟原虫。,涂制血膜规则,用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜
4、状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。涂片顺序，先厚后薄；位置分配，血片自左向右：薄-厚-标签；推薄片用玻片短边。,制作厚血膜,制作薄血膜,2023/3/12,7,厚血膜血量及涂片法,厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约45微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。,2023/3/12,8,薄血膜血量及涂片法,薄血膜 取洁净的载玻片2张，1张平置在桌上，以左手拇指，食指夹持载玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另一
5、张边缘平滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片，用推片一端边缘的中点从取血部分刮取约11.5微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成2535度夹角，待血液向两侧扩展约2厘米宽度时，均匀而迅速地轻轻向左推出（约2.5厘米长）且边缘带有“舌状”的薄血膜。,2023/3/12,9,涂制厚、薄血膜的位置,通常是将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法是将载玻片分为3等分（留出标签或磨砂面位置后的3等分）。厚血膜涂在载玻片靠近标签或磨砂面方向的右1/3中央处，圆形、厚薄均匀、边缘整齐。薄血膜涂在载玻片1/2至左1/3的中部位置，舌状、厚薄均匀。,2023/3/12,10,血片编号,血
6、膜制成后，立即将受检者的个人编号写在玻片磨砂面上（血片的编号要与血检登记本上编号一致）以防差错。,2023/3/12,11,制作血膜的注意事项,1.玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。,2023/3/12,12,制作血膜的注意事项,2.刚涂制的血膜要平放在标本盒内或者实验台面上。厚血膜未干前勿使标本片倾斜，以免未干的血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍
7、蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒内。新木制标本盒需敞开放置一段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜血红蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。,2023/3/12,13,制作血膜的注意事项,3.血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能2448小时内固定染色；冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（13分钟）然后用过滤清水或自来水对厚血膜溶血，晾干后包好置干燥器于冰箱内保存，用时将干燥器置室温中12小时后取出染色。,血片的染色（一）染液的种类及染色原理,染液种类：目前所用的血片
8、染色液，虽然名称很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的染液变化过来的。总的可分为水溶液和酒精溶液两大类，前者包括罗氏、西氏（Simon)、J.S.B氏染液等，后者包括利氏(Leishman)、瑞氏和吉氏染液（被国家推荐使用）等。这些染液中的主要染剂都包含美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青，所以称为多色性染剂。,2023/3/12,15,血片的染色（一）染液的种类及染色原理,染色原理：伊红是酸性水溶性钠盐，美兰是碱性水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的沉淀物染成红色。美兰主要离
9、解为碱性的美兰离子，美兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合染成兰色。,2023/3/12,16,血片的染色（一）染液的种类及染色原理,染色原理：美兰与伊红都不能使原虫和白细胞的核着色，必须由天青作为媒介（染媒）才能使其着色。天青虽然也是碱性染剂，但又具有染媒作用，使原虫核和白细胞核等原来只能染上极淡兰色的结构染上显著的酸性染剂伊红，这样，就使白细胞粗大的核染成显著的既兰又红的紫兰色，而较小或菲薄的原虫核和淋巴细胞原浆中的颗粒染成紫红色。,2023/3/12,17,血片的染色（一）染液的种类及染色原理,注意：蛋白质是二性电解质，当其处于较等电点为酸的溶液中时，
10、便呈碱的作用，即与酸或阴离子结合，这就说明为何在染液偏酸时，伊红的着色力强，使红细胞着色鲜艳而淋巴细胞和原虫的胞浆着色不显著；反之，蛋白质在偏碱的溶液中呈酸的作用而中和碱基，也就说明为何染液偏碱时，红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫兰色。伊红在水溶液内遇到美兰或天青，即可互相化合而产生沉淀从而失去染色力，因此，吉氏染液的母液绝对不能进水。,2023/3/12,18,血片的染色（二）吉氏染液母液配置方法,取吉氏粉0.5克置于研钵中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，至25毫升加完为止，倒入60或100毫升带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油染液混入瓶内，至25毫升甲醇洗净钵中甘油染液
11、为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于5560水浴中或温箱内24小时或室温内35天，多加摇动，即成原液。吉氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经久不变。,材料：1、吉氏粉0.5克 2、甘油25毫升 3、甲醇25毫升,2023/3/12,19,血片的染色（三）吉氏染液血片染色方法,血膜干燥后，用甲醇或无水酒精固定薄血膜，用过滤清水或自来水对厚血膜溶血，然后再进行染色。成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性蒸馏水98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色30分钟（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲
12、洗一次，干净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干镜检。,2023/3/12,20,血片的染色（三）吉氏染液血片染色方法,单张血片染色：薄血膜经甲醇固定干燥后，用2%吉氏染液稀释液12毫升，滴入血片标本上染色30分钟左右，或用中性蒸馏水12毫升，加吉氏母液12滴，混合均匀后滴入血片标本上，染色2030分钟，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。,2023/3/12,21,影响染色效果的因素,血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等有关外，还受到以下几个因素的影响：（1）染料溶剂的质量 染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲
13、醇和中性甘油，而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。,2023/3/12,22,影响染色效果的因素,（2）染液的新旧 新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制12周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。,2023/3/12,23,影响染色效果的因素,（3）染液稀释后使用时间 吉氏和瑞氏染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用，一般在半小时内染色力最强。,2023/3/12,24,影响染色效果的因素,（4）染
14、液的稀释浓度 染液的浓度高其着色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不明显或消失。,2023/3/12,25,影响染色效果的因素,（5）染色时间 染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。因此染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。,2023/3/12,26,影响染色效果的因素,（6）染色用水 染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择Ph7.07.2清洁水，通常使用的新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水，以及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓冲蒸馏水调整。染色
15、后发现血膜颜色偏蓝（偏碱）或偏红（偏酸）时，可用与之相反的酸、碱度水冲洗血片予以纠正。,2023/3/12,27,影响染色效果的因素,（7）染色后不要直接将染液残渣倒掉，应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污染片血膜。,注：用于薄血膜的染色和一般漂洗时，用蒸馏水稀释至1 000ml，用于厚血膜及同一张玻片上厚血膜与薄血膜的染色时，用蒸馏水稀释至500ml。,配制pH6.67.4缓冲液两种贮备液用量表,2023/3/12,29,血片制作和染色质量标准,2023/3/12,30,疟原虫计数法（实验室检验报告单）,全血膜发现同种、同期疟原虫数在10个以内均记实际数，10个以上但还不到平均每个视野一个虫登记“少”。如P.V.T少S3.G1，P.f.R少G2。平均每个视野同种、同期疟原虫数在15个时记“”如pfR+，610个以上时记“”如p.f.R+，10100个时记“+”，100个以上时记“”，如p.V.R+G+,p.f.R+。,2023/3/12,31,谢谢,
