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1、大肠埃希菌 山东聊城阿华制药有限公司 SOP-UIS 04 00 Shandong Liaocheng Ehua Medicine CO., LTD 山东聊城阿华制药有限公司标准操作程序 编 码 起草人 审核人 批准人 实施日期 SOP-UIS 04 00 日 期 日 期 日 期 版 次 01 检验SOP 控制菌检查 大肠埃希菌 1简述 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。用4-甲基伞形酮葡糖苷酸和靛基质试验检查大肠埃希菌，检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳
2、性或阴性即可报告结果。 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。实验证明，96%的大肠埃希菌含-葡糖苷酸酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色的反应强，易于观察。通常将MUG与靛基质试验结合，来检测大肠杆菌。如MUG与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。 2仪器、设备及用具 2.1无菌室 微生物检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。 2.2 净化工作台 2.3 培养箱。 2.4 高压蒸汽灭菌器。 2.5 显微镜。 2.6 恒温水浴。
3、 2.8 离心机。 2.9 电冰箱。 2.10 匀浆仪。 2.11 366nm紫外灯。 2.12 玻璃器皿、器具参照细菌、霉菌和酵母菌计数2.2.2。 3试液、指示液。 3.1 0.9%无菌氯化钠溶液。 3.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 3.3 pH7.2无菌磷酸盐缓冲液。 3.4 靛基质试液。 3.5甲基红试液。 - 1 - 山东聊城阿华制药有限公司 SOP-UIS 04 00 Shandong Liaocheng Ehua Medicine CO., LTD 3.6 V-P试液。 3.7 革兰染色液。 3.8 中性红指示液。 3.9 亚甲蓝指示液。 3.10 溴麝香草酚蓝指示液
4、。 3.11 酸性品红指示液。 3.12 曙红钠指示液。 4培养基 4.1 营养肉汤 4.2 营养琼脂 4.3 胆盐乳糖(BL)培养基。 4.4 4-甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基。 4.5 乳糖培养基、5%乳糖培养基。 4.6 蛋白胨水培养基。 4.7 磷酸盐葡萄糖胨水培养基。 4.8 枸橼酸盐培养基。 4.9 曙红亚甲蓝琼脂。 4.10 麦康凯琼脂。 5对照用菌液 菌液制备：取大肠埃希菌的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，置361培养1824h，取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿
5、或平板涂布，经培养后计数确定。 6准备 6.1 供试品的检验量见细菌、霉菌和酵母菌计数5.3。 6.2 供试液的制备。 6.2.1 液体供试品见细菌、霉菌和酵母菌计数7.1。 6.2.2 固体、半固体或粘稠液供试品见细菌、霉菌和酵母菌计数7.2。 6.2.3 非水溶性供试品见细菌、霉菌和酵母菌计数7.3。 7操作步骤 7.1检验程序 MUG阳性 、Indole阳性 361 MUG阴性 、Indole阴性 报告 - 2 - 山东聊城阿华制药有限公司 SOP-UIS 04 00 Shandong Liaocheng Ehua Medicine CO., LTD MUG蛋白胨 MUG阳性 、Indo
6、le阴性 5、24h MUG阴性 、Indole阳性 供试品供试液BL增菌培养液 EMB或麦康 361 疑似菌落361 革兰染色、镜检 361 凯琼脂平板 1824h 纯培养 1824h IMVi C试验 1824h 报告 阳性对照试验 各供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10100cfu，供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的各控制菌检查。阳性对照试应检出相应的控制菌。已做验证试验的供试品，在该供试品检查时不必再做阳性对照。 阴性对照试验 取稀释剂10ml加入100ml相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。 7.2 增菌培养 取胆盐乳糖(BL)培养基
7、2份，每份各100ml。1份加入10ml供试液(相当于供试品1g、1ml、1cm2)，另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。培养1824h，必要时可延止48h。阴性对照应无菌生长。 取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5、24 h在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。在紫外光下若管内培养物呈现蓝色荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG
8、阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。 7.3 分离培养 如呈现MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养1824小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。 大肠埃希菌菌落形态特征 培养基 曙红亚甲蓝琼脂 菌 落 形 态 呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽。 鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。 麦康凯琼脂
9、当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，若EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与上表所列菌落形态特征相符或疑似菌落者，应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和IMViC试验确认大肠埃希菌。 7.4 纯培养 如EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与上表相符或疑似者，以接种针轻轻接- 3 - 山东聊城阿华制药有限公司 SOP-UIS 04 00 Shandong Liaocheng Ehua Medicine CO., LTD 触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选23个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养1824h，作以下检查。 如平板上无单个可疑菌落，但有可疑团，应沾取可疑菌团培养物少许，或重
10、新取增菌培养液分区划线接种于EMB琼脂平板，培养1824 h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。 7.5 革兰染色、镜检 7.5.1 以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰23次固定。 7.5.2 滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。 7.5.3 滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。 7.5.4 滴加95%的乙醇，脱色2030s，水洗。 7.5.5 滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。 7.5.6 染色结果 革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。 大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆
11、菌状。 8生化试验 8.1乳糖发酵试验 取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养2448h，观察产酸，产气。为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5%乳糖发酵管。约大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24h出现阳性。可适当延长培养时间。 8.2 靛基质试验取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养2448h，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性。一般24h即可出现阳性结果。常以无菌操作先从管中取出1或2 ml培养液进行检查，如靛基质阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24h，作靛基质试验。 8.3 甲基红试验取上述斜面培养物
12、，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养482h，于培养液中加入甲基红指示液23滴，轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。 8.4 乙酰甲基甲醇生成试验(V-P) 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养482h，于2ml培养液中加入-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h内出现红色判为阳性，无红色反应为阴性。 8.5 枸橼酸盐利用试验取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养斜面上，培养24天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变，无菌苔生长 - 4 - 山东聊城阿华制药有限公司 SOP-UIS
13、04 00 Shandong Liaocheng Ehua Medicine CO., LTD 为阴性。 9结果判定 9.1 当阴性对照呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性，靛基质阴性，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。 9.2 MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为- + - - 、革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为+ + - -、革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。 9.3 供试品培养物检查不符合9.2中的任一项，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。 9.4 当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长但非大肠埃希菌。不能做出检验报告。 修 改 栏 序 号 修改章节 标 记 修改通知单号 修改人 修改日期 实施日期 - 5 -
