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1、第七章 生物技术与农业,2,contents,7.1 转基因作物7.2 生物农药,3,7.1转基因作物,7.1.1 抗植物病虫害基因及其应用7.1.2 抗非生物胁迫、改良作物品质的基因及其应用7.1.3 改变植物其它性状的基因及植物医药基因工程7.1.4 植物基因工程存在的问题,7.1.1抗植物病虫害基因及其应用,病害是农作物减产的主要原因之一全世界农作物产量损失的1/3可归因于病害植物虫害也使全世界每年损失数亿美元,化学农药的使用，带来“三R”难题,环境污染，残毒上升，人畜均遭毒害；害虫抗性增强，用药浓度不断提高，防治费用不断增加，不得不无休止地研制新农药；杀伤天敌，破坏生态平衡，引起害虫再
2、猖獗和大爆发，导致自然界中恶性循环。（Residue,Resistance,Resurgence）：残毒、抗性、再猖獗三大问题。,生物农药还不能取代化学农药,对特定害虫的高毒性，对环境的安全性抗虫谱窄，田间不稳定性目前世界农药市场上，生物农药的比重不足0.5%江苏省生物农药的生产量和使用量只约占农药生产总量和使用总量的0.5%和4.8%。http:/,常规育种获得抗病虫害品种,选育周期较长有些病虫害尚无基因资源作为杂交育种的亲本,袁隆平与谢华安,1980年，谢华安育出“明恢63”恢复系。明恢63配成的各种组合累计推广面积超过20亿亩，是迄今应用最广、持续应用时间最长、效益最显著的恢复系。,19
3、81年，用明恢63配成汕优，解决了第一代杂交稻不抗稻瘟病的致命缺陷。,植物抗病虫害基因工程,育种周期短、效率高、成本低提高产量和品质降低生产成本减少化学农药污染，避免破坏生态平衡克服亲本基因资源缺乏抗性性状具有连续性和整体性,抗病虫害基因来源,1.植物 如豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因。2.动物 如杀菌肽（cecropins）基因。3.微生物 如Bt杀虫结晶蛋白基因。,抗性基因分类,据基因的作用功能和对象分为：1.抗虫基因。2.抗病毒基因。3.抗真菌和细菌基因。,7.1.1.1 抗植物虫害基因,常用的主要有三种：Bt基因胰蛋白酶抑制剂基因植物凝集素基因,a)Bt基因,根据杀虫谱的不同，将杀
4、虫基因分成六大类，统称为cry基因，用罗马数字I、II、III、IV等来命名，分别代表几种杀虫范围。在每一类型下根据氨基酸序列的同源性，又分为A，B，C等不同的基因型。在同一基因型下根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为a，b，c等不同的基因亚型。,1987年，世界上4个研究小组获得转Bt基因植物目的基因：CryIA（b）全长，片段；CryIA（a）片段；CryIA（c）全长；转化方法：农杆菌介导法转化植物：烟草（3）番茄（1）（Monsanto）抗虫性：烟草天蛾，番茄果螟,转Bt基因植物（表一）,转Bt基因植物（表二）,转Bt基因植物（表三）,植物抗虫基因工程的研究进展，东北农业大学学
5、报，2000。,b)蛋白酶抑制剂基因,蛋白酶抑制剂（PI）,自然界最为丰富的蛋白质之一存在于绝大多数生物体尤其是许多植物的贮藏器官一种天然的抗虫物质在植物界，现已发现近10个蛋白酶抑制剂家族,原理,与昆虫消化道内的蛋白消化酶相结合，形成酶抑制剂复合物（EI），从而阻断或减弱昆虫蛋白酶对于外源蛋白质的水解作用，导致蛋白质不能被正常消化同时EI复合物能刺激昆虫过量分泌消化酶，导致昆虫产生厌食反应。最终，昆虫缺乏生活一些必需的氨基酸，而发育不正常或死亡。蛋白酶抑制剂分子可能通过消化道进入昆虫的血淋巴系统，从而严重干扰昆虫的蜕皮过程和兔疫功能，以致昆虫不能正常发育。,PI的作用特点,作用于蛋白消化酶的
6、活性中心。活性中心是酶最保守的部位，产生突变的可能性极小，故可以排除害虫通过突变产生抗性的可能性。PI对于人、畜无害。人、畜的蛋白消化酶主要存在于肠道中，而PI在胃中的酸性条件下，被胃蛋白酶分解。,PI的分类,植物中存在三类：（1）丝氨酸蛋白酶抑制剂（2）巯基蛋白酶抑制剂（3）金属蛋白酶抑制剂,与抗虫基因工程关系最密切、研究最深入的是丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中最主要的是胰蛋白酶抑制剂。绝大多数昆虫所利用的正是这一类消化酶，而植物细胞基本没有这种酶，或含量甚微。,豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（CpTI基因）、马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因（PTI基因）、玉米半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（CPI基因）以及大豆胰蛋白
7、酶抑制剂基因（SKTI基因）等。,豇豆胰蛋白酶抑制剂CpTI,抗虫效果较为理想，其抗虫范围广对鳞翅目、鞘翅目、直翅目等几乎所有昆虫都有杀伤作用目前已应用于抗虫烟草、水稻、大豆，但由于其表达能力不够强，应用暂时受到限制。,转蛋白酶抑制剂基因植物,c)植物凝集素（lectin）基因,非免疫来源的糖蛋白或结合糖的蛋白质(sugar-binding protein)能聚集细胞和（或）沉淀糖蛋白主要存在于细胞的蛋白粒中最主要的特性是能和糖类结合 多数是一些寡聚蛋白,二聚体或四聚体，少数含有两个糖结合部位的单体，如蓖麻毒蛋白。豆科植物的种子中含量最丰富,原理,当被昆虫取食后，外源凝集素在昆虫的消化道中与肠
8、道围食膜上的糖蛋白专一性结合（即不同的外源凝集素与相应的糖类结合），从而影响营养的吸收。可能在昆虫的消化道内诱发病灶，促进消化道中细菌的繁殖。,主要种类,麦胚凝集素（wheat germagg1utinin，GA）雪花莲（Galanthus nivalis，GNA）凝集素 豌豆外源凝集素（pea-lectin,p-Lec）,雪花莲,虽然外源凝集素有很强的抗虫作用，但如果转入食用性农作物特别是生食的蔬菜类中，对人和家畜有无毒副佐用还需要进一步证实。因此，目前其大规模大面积应用还是受到了一定的限制。,抗虫转基因新思路,为了对付棉铃虫，棉花体内天生就有一种名叫棉酚的毒素。相应地，棉铃虫也有一种名叫P
9、450的基因参与解毒，可化解棉酚的毒性，帮助棉铃虫逃过此“劫”。中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所研究组采用RNA干扰技术，将具有干扰作用的昆虫双链RNA转入植物体内。棉铃虫食用了此种转基因植物后，干扰RNA就渗透入棉铃虫消化食物的中肠壁内，从而“直捣”棉铃虫体内的解毒基因P450。这些棉铃虫就像慢性中毒一样，对棉酚的抵抗力大大减弱，蚕食棉花的胃口随之骤减，生长缓慢，甚至死亡。,自然杂志评价该论文是“第一次成功报道利用植物自生表达昆虫基因的双链RNA来抑制植食性昆虫防御基因的论文”，“通过该技术改良的植物比利用杀虫剂不分青红皂白地将所有昆虫杀死更符合社会发展的需要。”http:/,另一
10、篇文章也是类似的思路。PNAS,2006，103（39）：14302-14306,7.1.1.2 抗病毒基因,病毒病引起的作物病害是十分严重的，仅以马铃薯为例，病毒(PVX)引起的产量损失可10%,Y病毒（PVY）引起的损失可达80，然而迄今杂交常规育种对病毒病的防治尚无良策。,常用的抗病毒基因,外源病毒外壳蛋白（coat protein，C）基因病毒复制酶基因 病毒卫星RNA基因核糖体失活蛋白（RIP）基因 干扰素基因 等等,Monsanto公司，1988年，获得了表达TMV的CP基因的番茄品种VF36的转基因植株。在接种后表现出延迟发病，发病率小于5%，产量几乎不受影响，而对照植株则100
11、%发病，果实减产26-35%。,Monsanto公司，1990年，把PVX和PVY的CP基因同时导入北美最重要的马铃薯品种usset Burbank，其中筛选出的一个转基因株系在接种条件下，完全抗PVX和PVY。田间试验表明,传毒蚜虫接种16周后,转基因植株只有8%的发病率,而对照植株的发病率却高达79.3%。,a)病毒的外壳蛋白(CP)基因,b)核糖体失活蛋白(RIP)基因,是单链的碱性蛋白质。分子量约为30kD，带有或不带有糖基，但其生物活性都一样，都具有抑制无细胞蛋白质生物合成的作用,对完整细胞或动物呈无毒或低毒。,是由A、B两条肽链通过二硫键组成的二聚体。分子量约为60kD。其A链与I
12、型RIP同源呈酸性或碱性，是毒性分子。B链是凝集素，能结合到细胞膜表面并协助A链进入细胞。,I型RIP：,II型RIP：,RIP是一类能抑制蛋白质生物合成的蛋白，广泛存在于高等植物中，含量丰富。部分真菌中也含有此类物质。,常见的RIP,商陆毒蛋白、蓖麻毒素相思子毒蛋白、苦瓜毒素,商陆,蓖麻,相思子,RIP作用机理,RIP选择性作用于60S核糖体大亚基，抑制肽链延伸。大多数植物和细菌中的RIP是通过它的N一糖苷酶（N-g1ycosidase）活性来抑制蛋白质合成的功能。它特异地作用于28rRNA（核糖体大亚基上）的第4324位核苷酸的腺瞟呤与核糖之间的N一糖苷键，进行水解，除掉腺瞟呤，使核糖体失
13、活，不能合成蛋白质。真菌中的RIP则通过其核酸酶（RNase）活性起作用，RIP专一水解真核细胞核糖体28rRNA第4325和4326位核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的RIP分别对于病毒、真菌和昆虫具有不同的抗性。能使植物获得广谱抗性。,RIP的抗病毒活性,RNA N-糖苷酶活性（植物、细菌来源）水解rRNA 特定位点的腺苷酸的N-C糖苷键，释放一个腺嘌呤残基，致使核糖体无法与延伸因子EF-Tu和EF-G结合 RNA水解酶活性（真菌来源）-帚曲霉素（水解位于28s rRNA上特定位点的磷酸二酯键，引起构象变化）,7.1.1.3抗真菌和细菌基因,几丁质酶基因-1,3-葡聚糖酶基因,a)几丁质酶基因
14、,许多病原真菌的细胞壁主要成分为几丁质，而植物中还未发现几丁质酶的底物几丁质的降解，不仅破坏细胞新物质的沉积，致使病原菌死亡，而且产生的细胞壁碎片具有诱导作用，刺激寄主植物的抗病反应几丁质酶：水解酶，通过破坏几丁质而抑制病原菌的生长,b)-1,3-葡聚糖酶基因,水解-1,3-葡聚糖的作用-1,3-葡聚糖酶也是真菌细胞壁的主要碳水化合物-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶具有协同的抗真菌作用，因此常将两种基因同时转入植物中。,7.1.2 抗非生物胁迫、改良作物品质的基因及其应用,胁迫(stress)：指对植物生存及生长不利的各种环境因素的总和。胁迫分为生物胁迫和非生物胁迫两大类。生物胁迫是指病害和杂草。
15、而非生物胁迫则指不利的理化因子，如温度（高温、低温）、水（旱、涝）、辐射（红外、紫外、离子、可见）、化学因素（盐类、气体、除草剂等）、风雨雪电等。,抗除草剂基因工程抗冻基因工程（抗冻蛋白、脯氨酸合成酶、甜菜碱合成酶）改良作物品质基因工程,抗冻草坪草的基因工程,作物品种质量,1.控制果实成熟期的基因及其应用2.谷物种子贮藏蛋白基因及其应用3.改良脂肪酸组成的基因工程,7.1.3改变植物其它性状的基因及植物医药基因工程,改变植物花色的基因工程植物雄性不育基因工程植物抗体基因工程,7.1.4植物基因工程存在的问题,转基因植物安全性评价 环境安全性转基因植株的扩散外源基因的扩散标记基因的扩散影响生物多
16、样性食品安全性是否会促进害虫等相关物种的进化标记基因的毒性食用部分对食用者的过敏反应对国际贸易的不可预测的影响,46,7.2生物农药,7.2.1 生物农药的产生背景7.2.2 生物农药的研究概况7.2.3 生物农药的主要研究内容,47,7.2.1 生物农药的产生背景,我国现已成为世界第一化学农药生产和使用大国，单位面积平均化学农药的用量比世界平均用量高2.5-5.0倍；每年遭受残留农药污染的作物面积达12亿亩，其中污染严重的比率达40%，特别是蔬菜、水稻、果树和茶叶等作物；每年仅因蔬菜农药残留超标导致的中毒事故就达10万人次，每年因农药残留超标造成的外贸损失高达70亿美元。,48,新的化学农药
17、开发难度不断增大，研发成功一个新品种不仅要花费巨资，至少需耗时8-10年，全球仅有少数大公司才有能力进行化学农药创制。我国经过多年努力，虽然取得了一定成绩，但未能从根本上改变我国化学农药以仿制为主、缺乏自主知识产权的局面，化学农药创制能力难以与国外农药大企业形成竞争。,49,生物农药,由于化学杀虫剂的诸多缺点，人们始终在寻找控制害虫的更为安全有效的方法。生物农药就是人们的选择之一。不同学者、不同机构、组织对生物农药的内涵意见不同。目前并没有统一的定义。,目前世界上生物农药使用量最多的国家有墨西哥、美国和加拿大等国，占世界总量的44。欧洲的生物农药使用量占全世界的20，亚洲占 13，大洋洲占 1
18、1，拉美洲和加勒比湾占9，非洲占3。,来自天然源材料如动物、植物、微生物及某些矿物质等的低风险农药。截止2008年，在美国登记的生物农药有效成分达245个。-主要包括3大类：,美国EPA关于生物农药的定义,（1）微生物农药（microbial pesticides）（2）转基因植物农药（Plant-Incorporate-Protectants，简称PIPs）（3）生物化学农药（Biochemical pesticides）,51,中国农业百科全书农药类中生物农药(biogenic pesticides)是指的是利用生物资源开发的农药。其狭义概念指直接利用生物产生的天然活性物质或生物活体作为农
19、药（生物体农药）,广义概念还包括按天然物质的化学结构或类似衍生结构人工合成的农药（生物化学农药）。,生物源农药：来源于生物、可用作农药（通过登记）的生物活体（生物体农药）和生物活性物质（生物化学农药）以及人工合成的与天然产物结构完全相同的化合物（仿生农药）。,生物农药：直接利用生物活体（微生物、动物、植物）作为农药。如微生物农药、昆虫天敌、转Bt基因的棉花等。,我国学术界讨论式的定义,我国农药管理部门对生物农药的定义,我国在农药登记资料规定没有制定明确的生物农药定义标准，主要参考FAO、美国等国际组织或国家的相关标准，通常将微生物农药（microbial pesticides）、生物化学农药（
20、Biochemical pesticides）、植物源农药（Botanical pesticide)、天敌生物、转基因生物统称作为生物农药。,53,（截止2009年12月的统计结果，包括单剂和混配药剂）,7.2.2生物农药的研究概况,我国生物农药登记注册情况,国外有的品种我国基本都能生产；已形成4个拳头产品：井岗霉素、阿维菌素、Bt、赤霉素等，生产规模在世界上处于领先地位；还形成一批重要品种，如农用链霉素、农抗120、苦参碱、多抗霉素、中生菌素等。,目前我国生物农药的生产特点：,2008年，我国生物农药产量达到22.59万吨，同比增长11.5%，较2004年翻了近一番。,生物农药产量,2004
21、-2008年我国生物农药产量及增长情况,57,7.2.3 生物农药的主要研究内容,农用抗生素动物源农药植物源农药微生物源农药生物化学农药转基因植物天敌生物,58,a）农用抗生素,品种很多,产业化程度最高,是一类用途最广泛的生物农药,可用于防治植物病虫草害和畜禽病虫害。目前应用于防治植物病害的抗生素，主要来源于放线菌中的链霉菌属。农用抗生素的优点：生物活性半寿期短，不易在植物体内积累。用量很少，对环境没有污染。在防治植物病害的同时，还能刺激植物生长。,b)动物源农药,目前，关于动物源农药的研究还比较有限，虽然对蛇毒、蜂毒、蚁毒、沙蚕毒素、斑蝥毒素等动物毒素也已作了较为深入的研究，但基本上没有投入
22、市场的产品出现。以沙蚕毒素为前体，合成了一系列高效、低毒的优秀农药产品，如杀螟丹（cartap，巴丹）、杀虫双（bisultap）、杀虫环（thiocyclam）等。,59,60,c）植物源农药,目前，已对约5-15%的已知植物进行了生物活性调查.据1988的报道，全世界约有2400种植物具有控制害虫的生物活性。植物杀虫有效成分主要是生物碱类、萜烯类、萘醌类、黄酮类、甾类等,它们对昆虫具有毒杀、拒食、引诱、驱避、绝育、调节昆虫发育等作用。生物碱类:是植物中最毒的成分,对昆虫具有毒杀、拒食和抗生作用,主要有烟碱、百部碱、藜芦碱、苦参碱、喜树碱、次喜树碱、乌头碱等。,杀虫活性的 1000多种，杀螨
23、活性的 39种，杀线虫活性的 108种，杀鼠活性的 109种，杀软体动物的 8种；,对昆虫具有拒食活性的 384种，忌避活性的 279种，引诱活性的 28种，引起昆虫不育的 4种，调节昆虫生长发育的 31种，抗真菌活性 94种，抗细菌活性 11种，抗病毒活性的 17种。,我国植物源农药登记注册情况,64,d)微生物源农药,我国已商品化的微生物农药主要是以微生物活体或其代谢产物制成。至2009年我国已注册登记的各类微生物农药有效成分17种，包括枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌、木霉菌、淡紫拟青霉、球形芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌及10种昆虫病毒，登记农药产品246个。,主要品种有：细菌类农
24、药：B.t.杀虫剂、芽孢杆菌制剂等；真菌类农药：白僵菌、木霉菌等；病毒类农药：斜纹夜蛾核多角体病毒、棉铃 虫核多角体病毒等；农用抗生素：井冈霉素、浏阳霉素、多抗霉 素、阿维菌素等；,目前我国有近90家科研院所、大专院校开展微生物农药的研究，大约有200家微生物源农药生产企业。,66,苏云金芽胞杆菌,苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis,Bt)是细菌杀虫剂中的代表,目前已鉴定了70个血清型、82个亚种。能感染130多种鳞翅目幼虫和一些膜翅目、双翅目、直翅目和鞘翅目的一些昆虫，如吉卜赛毒蛾、小菜蛾、松毛虫、枞色卷蛾等,Bt的主要产品剂型,蔬菜-水剂，撒粉剂水稻-油剂，粉剂林木-油剂，粉剂
25、卫生-漂浮粒剂,棉花,蔬菜,水稻,林木,玉米,蚊子,其它,Bt 的主要市场,Bt主要防治对象,小菜蛾菜青虫棉铃虫玉米螟稻 螟松毛虫蚊子幼虫,70,中国科学院武汉病毒研究所,http:/,71,e)真菌源农药,杀虫真菌目前世界上记载的约有100属800多种。半知菌亚门集中了50%的杀虫真菌，其中以白僵菌、绿僵菌、拟青霉、虫霉等应用较多,全世界先后有50多个产品登记注册。,我国自2008年第一个杀虫真菌农药“杀蝗绿僵菌”母药和油悬浮剂获得正式登记以来，目前已登记17个产品。其中：,已临时登记9个产品，包括3个母药和5个制剂，用于防治松毛虫、蛴螬、蝗虫、小菜蛾、天牛。,绿僵菌:,已正式登记4个产品、
26、临时登记4个产品，包括3个母药和5个制剂，用于防治蝗虫、蟑螂；,白僵菌:,与国外相近，近年真菌农药登记品种增加迅速，但是能够规模化生产的产品很少。我国绿僵菌防治蝗虫每年应用面积300-500万亩；白僵菌防玉米螟500万亩，防治松毛虫约500万亩。,73,真菌的杀虫机理,分生孢子附着于虫体表面孢子吸收空气中的水分而膨胀、萌发，长出芽管并借机械力量和分泌的酶，溶解虫体表层组织的主要成分几丁质，从而侵入虫体内。有的孢子则通过呼吸道或消化道进入虫体内。芽管通过吸收虫体内的水分和养分，不断伸长、分枝、增殖，并侵入器官部位，使整个虫体充满菌丝体而死亡死虫内的菌丝体产生分生孢子，穿过虫体表层飞扬和随风流动感染其他虫体，形成昆虫流行病。,74,侵染后的玉米螟,75,生物农药存在的问题,药效反应慢，而且稳定性也较差在生产、储藏、运输及使用过程中对环境条件的要求十分苛刻往往仅对有限的几种害虫有效,76,要点,生物农药、苏云金芽胞杆菌、杀虫晶体蛋白（Bt蛋白）、白僵菌、绿僵菌、生物农药与传统的化学农药相比，有何优点？缺点？Bt的杀虫原理（芽胞和杀虫晶体蛋白）？白僵菌的侵染机理？常用的杀虫、杀菌（细菌、真菌）、抗病毒的基因？,
