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1、实验五 叶绿体的分离与荧光观察实验五 叶绿体的分离与荧光观察 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。 实 验 目 的 一、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 二、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 实 验 原 理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘
2、度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 molL氯化钠或0.4 molL蔗糖溶液)中进行以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 rmin的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000 rmin的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体。分离过程最好在05的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行
3、观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间有必要时立即拍照。另外，在制作荧
4、光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 实 验 用 品 一、器材 1主要设备：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。 2小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。 二、材料 新鲜菠菜。 三、试剂 0.35 molL氯化钠溶液，0.01吖啶橙(acridine orange)。 实 验 方 法 一、叶绿体的分离与观察 1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml 0.35 molL NaCI溶液中，装入组织捣碎机。 2. 利用组织捣碎机低速(5 000 rmin)匀浆35m
5、in。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4. 取滤液4ml在1000 rmin下离心2 min。弃去沉淀。 5. 将上清液在3000 rmin下离心5min，弃去上清液，沉淀即为p为叶绿体(混有部分细胞核)。 6. 将沉淀用0.35 molL NaCl溶液悬浮。 7. 取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 在普通光镜下观察。 在荧光显微镜下观察。 取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴001吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察。 二、菠菜叶手切片观察 用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加12滴035molL
6、NaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。 在普通光镜下观察。 在荧光显微镜下观察。 用同样方法制片，但滴加12滴0.01吖啶橙染液染色l min，洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观察。 实 验 结 果 一、叶绿体的分离和观察 1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 2. 以Olympus荧光显微镜为例，在选用B(blue)激发滤片、B双色镜和0ss。(orange)阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。 3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。 二、菠菜叶手切片观察 1. 在普通光镜
7、下可以看到三种细胞 (1) 表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。 (2) 保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。 (3) 叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。 叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。 2. 在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈，表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。 3. 用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光，气孔仍为绿色。 作 业 1. 在普通光镜下，用目微尺和台微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测量5l0个叶绿体，求其平均值。 2. 在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化? 3. 游离叶绿体和整体细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，其颜色和强度有无差异?为什么? 思 考 题 1. 叶绿体分离的实验原理是什么?在分离叶绿体时应注意些什么问题? 2. 普通光镜与荧光显微镜有何异同点?
