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1、实验十 细胞电融合方法实验十 细胞电融合方法 实 验 目 的 动物的游离细胞以及植物或微生物去壁后的原生质体，在电刺激下可进行细胞融合，且融合率高、无毒性、操作简便及融合后的细胞继续培养成活率高等特点，是细胞工程手段的又一进展。 本实验使学生在了解电融合原理的基础上，学会掌握各种细胞悬液的制备及电融合过程的操作方法。 实 验 原 理 将制备的游离细胞或原生质体，置于电融合室中，在高频交流电场的作用下，细胞被极化，成为偶极子，造成细胞之间相互连接，如果施加的高频交流电压(即正弦波的P-P值)过高或作用时间过长，则细胞连接成串珠状，应适当控制以上条件，尽量使两细胞处于点接触状态；然后施加方波脉冲予
2、以刺激，由于电脉冲的瞬间作用，可击破两细胞接触点 部位的质膜，此时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，使两细胞融合逐步完成。 实 验 用 品 一、仪器及器材 JCF-1型细胞电融合仪、细胞融合池、普通离心机、倒置显微镜、刻度离心管、不锈钢网、镊子、解剖刀、解剖剪、注射器、毛细吸管、小烧杯、滴瓶、培养皿、毛笔等。 二、药品 甘露醇、蔗糖、氯化钠、纤维素酶、离析酶蜗牛酶、CaCl22H2O、MES(2-N吗啉已烷磺酸)、葡聚糖硫酸钾等。 三、材料 植物材料：甜菜、烟草或菠菜等。 动物材料：鸡或人等的红细胞、白细胞、骨髓瘤或腹水瘤等各种瘤细胞。 实 验 方 法 如果只观察细胞的融合过
3、程和掌握电融合方法，本实验所有步骤均可在有菌条件下操作。 一、植物原生质体的制备 1. 取幼嫩的叶片或充分展开的子叶，先用水洗净并吸去表面的水份，再置入小烧杯中将叶片剪成碎块。 2. 将碎块放入1.5纤维素酶、0.3离析酶、0.5蜗牛酶、0.6 molL甘露醇、5 mmolL CaCl22H2O、MES 3 mmol/L、葡聚糖硫酸钾0.3，Ph5.6的酶液中，置于25暗处游离5h (或15过夜)，游离时间结束时，可镜检原生质体分离情况，如果大多数原生质体还未从组织中释放出来，需增加在酶液中的游离时间。新出厂的酶在5h内一般就可将原生质体游离出来，但因药品质量问题或存放时间过长，致使酶活力下降
4、，要适当延长酶解时间。 3. 将酶解出来的原生质体用不锈钢网过滤，以除去未被酶解的组织，过滤后再用0.6 M的蔗糖冲洗网上残留的原生质体，然后以200 rmin进行离心处理5min。 4. 用带长针头的注射器吸去上清液，然后加入11.5ml 0.2 molL的CaCl22H2O，将原生质体混匀。 5. 用细头滴管或带长针头的注射器向管底慢慢注人20的蔗糖液，再以300 rmin离心10min，此时可见到在上下两液体间的界面处有一层乳白质的带状物，即为纯净的原生质体，其破碎的部份及其它杂质都沉降到离心管底部，用长针头注射器或毛细吸管分别吸去管底的杂质和蔗糖液以及原生质体上层的CaCl2液。 6.
5、 向离心管加入2ml 0.2 molL的CaCl22H2O溶液，混匀后以300 rmin离心5min，去掉上清液，最后用0.6molL的甘露醇溶液稀释并调整每毫升含5104个原生质体。 二、动物细胞的制备 用灭菌的注射器先吸入ALsver液(葡萄糖2.05g，枸橼酸钠0.8g，NaCl 0.42g，加重蒸水至l00ml) l ml，再从鸡的翼下静脉取血0.5ml，取出后放入刻度离心管中，再加入23ml ALsver液，使总量为45ml，混匀并封口，置于4冰箱内可供一周内使用，实验时取贮备的鸡血细胞l ml，加入4ml 0.85生理盐水，混匀后以1200 rmin离心5min，去上清液后、再加入
6、0.6 molL的甘露醇液(或0.6 molL蔗糖溶液)混匀后以上述离心条件洗涤两次，最后用0.6 molL的甘露醇液将鸡细胞稀释并调整成每毫升含2105个。 如采用传代培养的骨髓瘤或腹水瘤细胞，可先用0.9的生理盐水洗涤两次，离心速度为8001 000 rmin，每次5min，再用0.6 molL的甘露醇或蔗糖液洗涤两次，每次600800 rmin，离心5min，最后用甘露醇调整成每毫升含瘤细胞1105个。 三、细胞电融合方法 1. 仪器结构和使用方法 JCF一型细胞电融合仪的各项技术参数是通过大量的融合实验数据，并参考岛律公司(日)SSH型电融合装置的参数值而设计的(图23-1)。当打开电
7、源，指示灯亮，并拨通输出开美卿正弦输出开、关，再选择和按下正弦频率按键(共分为0.6、0.8、1、1.3、1.5MHz五档)，此时将输出电缆与示波器相接，在示波器上即出现高频正弦波形，当左右旋转正弦幅度旋钮，则正弦电压的P-P值，也随之降低和升高，如果将输出电缆与电融合室相接，则细胞相互连接。此时再旋动正弦幅度(即正弦电压)旋扭，则仪器上电压表指针随之升高和降低。如果正弦电压过高，则细胞连接速度加快，并呈串珠状，不利于两细胞融合。 将正弦输出开关搬至“复合输出”档，根据所需功率大小选择复合输出I或档，l档为低功率，II档为高功率；再根据实验要求，选择并按下你所需要的“脉冲宽度”按键(分Ims、
8、0.2ms、0.1 ms、l0s、ls五档)和“脉冲幅度”按键(分50V、I00V、150V、200V、250V五档)，还配有脉冲幅度旋钮(细调)，调整范围050V，可使每档增值50V。 施加脉冲刺激可分为“自控”和“手控”两档，当使用“自控”输出脉冲时，先将开关搬向自控档，然后根据需要选择并按下“脉冲频率按键(分为2s1次及每秒1次、2次、5次、10次共五档)，即可自动发送电脉冲；如果将开关搬至“手控”档，需按动“手控”按扭，每按动一次发送一个脉冲。无论自控或手控输出，每个脉冲输出都伴有报鸣音响，将输出端与脉冲示波器连接，则可观察到由脉冲宽度、幅度及脉冲间隔所构成的示波图像，当改变以上有关参
9、数值时，其图像亦发生变化；把开关搬向方向，则产生负脉冲，当脉宽和幅度等值不变时，其图像与正脉冲波形相同，但方向相反，上下对称。将电缆输出端与电融合室的两电极相接，并按上述要求发送一定的方波脉冲，细胞受到电刺激后，可产生融合。 2. 电融合操作 植物原生质体融合 (1) 开启电源，关闭“输出开关”，将开关搬向正弦输出档，此时可根据实验需要，将正弦频率选择在11.3MHz，脉冲宽度为0.1ms或10s，脉冲幅度为150V，脉冲频率为1次s，并依次按下各标定按键，最后调整正弦电压(即正弦幅度)旋扭，使电压表处于5l0V处。 (2) 将电融合池内两电极距离调整成11.5min，并用毛细吸管吸取制备的原
10、生质体悬液约0.10.2ml置融合池中，盖上盖片，注意在融合池中，特别是在两电极间不能容有气泡。 (3) 将融合池置于显微镜载物台上，并将两电极的输出端与仪器的输出电缆接通，然后用低倍镜(10xl0)找出融合室中央两电极间的焦面，此时可观察到原生质体呈平均分布状态，互不接触。 (4) 打开输出开关，原生质体在高频交流电场作用下，迅速按电极垂直方向排列，此时应控制正弦电压大小，如果原生质体接触缓慢，可适当提高正弦电压；如果原生质体间接触过快，应立即降低电压，否则相互接触的原生质体很快会连接成串珠状。 (5) 选择两个相互接触的原生质体，并转向高倍镜(10X 40)观察(图23-2-A)，将开关搬
11、向复合输出，然后将控制开关搬向“自控”档，此时会按给定的频率发出连续脉冲，每一脉冲都伴有报鸣音响，两原生质体每接受一次脉冲刺激后，在视野中可观察到产生轻微颤动，当连续发送510个脉冲刺激后，约30s内可观察到两原生质体接触点处的质膜被击破穿，并开始融合(图23-2-B)，经过7至10几分钟，原生质体逐步融合(图23-2-E)，当融合的两细胞变成一个圆球形，融合过程结束(图23-2-F)，如果此时再观察电融合室中两电极间其它部位，由于原生质体大小的不同决定其表面张力及其膜特性的差异，可观察到有的已融合完毕，有的正在融合之中，即两原生质体有的呈亚铃状，有的呈长圆形或卵圆形。 动物细胞融合的融合方法
12、及条件基本同上，但因动物细胞的膜结构(特别是红细胞膜)比原生质体具有更大的电刺激耐受性，因此要造成细胞接触点处的膜击穿，蔫要适当加大脉冲桃、脉冲宽度或增加刺激次数，通常在做动物细融合时，当电极距离在11.5mm范围，可将脉冲电压调到200250V，脉冲宽度调至0.l ms，电刺激次数为1015次；如果以鸡红细胞为融合材料，当施如以上电刺激参数后，可在显微镜下观察到很多的双核体细胞。 附一 影响细胞电融合的因素 一、用于供原生质体或动物细胞悬浮的介质，必须满足两个条件：一是为了保持细胞的生物活性，使融合后的细胞能继续存活，并通过培养能继续分裂和分化，其介质要求与细胞本身具有等渗性；二是为了保证融
13、合之前所施加的各项电参数充分发挥作用，其介质应具有高纯度的非离子溶液，如果在溶液中存在Na+、K+、Ca2等金属离子或CI离子，将使介质的导电性增加，当施加脉冲波刺激时，椐报导，其总能量Q将通过离子的传导作用损失80以上，而直接通过细胞，用于击穿膜接触点使其细胞融合的能量仅占l020，当有离子存在并使电脉冲能量高度损失的情况下，将不能保证细胞进行融合。 在介质中有金属离子存在，当施加高频正弦波电场时，不能将细胞极化成偶极子，从而不能使细胞间相互接触和连接，更谈不上细胞间相互融合。 为了解决以上存在的问题，一是采用高纯度的蒸馏水(三蒸水或四蒸水)来配制介质，二是选用适当的非电介质溶质，如甘露醇、
14、山梨醇或蔗糖等来配制供细胞悬浮的等渗溶液，另外，在清洗电融合室时，也要以高纯度的蒸馏水用毛笔擦净。 二、在做原生质体融合时，其原生质体游离的状况对完成细胞融合至关重要，游离出好的原生质体应具有折光性强，呈饱满的球状体，质膜与细胞质无明显界限，此种原生质体在电刺激下很易融合。当观察到原生质体不呈现球状体，且折光性差，呈暗褐色，细胞的质膜部位有一层较厚的膜状物，这与游离过程脱壁不净有关，此种原生质体在电刺激下很难产生融合，如果继续加大各项电参数刺激，则细胞被击破。 三、根据近几年国外报导，在细胞悬液中加入链霉蛋白酶E(pronase E)，可改变细胞膜结构，并增强膜活性，按每毫升13mg配制，能使
15、细胞融合率增高，我们利用0.6 molL的甘露醇液配制成每毫升含pronase E l mg做为细胞悬液，然后按每毫升含鸡红细胞2105个，在37下温育30min，然后接原定各项电参数进行电融合，其融合率比未被酶处理的大幅度提高。 另外，在应用化学融合剂PEG进行细胞融合时，通常以XN液l作为稀释剂，一般使用浓度都在50左右，对细胞的毒性作用较大，虽然在融合后马上进行洗涤，但融合后经过培养阶段，融合细胞的存活率仍然很低。我们的实验证明，如果以0.6 molL时甘露醇作溶剂，配制成6 8的PEG(Mw=4000)作为细胞悬液，再按上述条件进行电融合实验，其融合速度和融合率与不加PEG相比都有提高
16、。 附二 利用聚乙二醇(polyethyleneglycol，简称PEG)为媒介物进行细胞融合 一、实验目的和原理 在掌握利用聚乙二醇为介导物对各类细胞的融合方法。当前普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。 二、溶液配制 1. Alsver液(同前) 2. 0.85生理盐水液 3. GXN液 NaCl 8g，KCl 0.4g、NazHPO42H2O 1.77g、Na2HPO4H20 0.69g，葡萄糖2g，酚红(phenol rad)0.01g，溶于1 000ml重
17、蒸水中。 4. 50%PEG液 实验前临时配制，根据需要称取定量PEG(Mw=4 000)，放人刻度试管或刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其熔化，如做细胞培养融合实验，可用高压蒸汽灭菌30min，待冷却至50，加入预热至50等体积的GKN液，混匀。 三、融合方法 1. 取制备的鸡红细胞(制备方法同前)悬液l ml，加入4ml 0.85 生理盐水，混匀后以 1 200rmin离心5min，去上清液后，再以上述条件离心洗涤两次(5min、10min)，如果采用各种瘤细胞，只将洗涤液改为09的生理盐水，其它条件同上。 2. 将最后一次离心沉降的鸡红细胞或有关瘤细胞(去上清液)，加入23ml GKN液
18、 待用。 3. 取以上悬液，用血细胞计数法计数，再以GKN液将鸡红细胞稀释成每毫升含2105 个，瘤细胞每毫升含1.5105个。 4. 如做同种细胞间融合，可取有关细胞悬液l ml，加入50的PEG液混匀，置于30水浴内温育1015min；如采用异种细胞(如鸡红细胞与腹水瘤细胞)，可分别取0.5m ml，再加GKN液一起混匀，其它步骤同上。 5. 用吸管或移液器吸取以上细胞悬液0.10.2ml，滴在薄底小培养皿中，利用倒置进行观察。 四、结果 在倒置显微镜下可观察到由同种细胞融合形成的细胞，称为同核体(homokaryons)，利用亲本的不同细胞彼此融合所形成的细胞，称为异核体(heterokaryons)，还可观察到3个以上细胞融合在一起的合胞体。 细胞融合率系指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，称为融合率，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为准确。 作 业 1绘图表示所观察到的融合细胞。 2请写出细晌电融合的注意事项。 思 考 题 1说明细胞电融合的原理。 2在细胞电融合中，设对细胞产生可逆性电击穿的总能量为Q，如何理解各项电参数之间及其与Q值的关系?
