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1、实验二 细菌培养与代谢产物检查实验二 细菌培养与代谢产物检查 学习并初步掌握基础培养基制备方法。 了解细菌生长繁殖所需要营养以及常用培养基的种类和用途。 了解细菌所具有的不同生化反应及代谢产物，以利细菌的鉴定和鉴别。 规范地进行无菌操作。 一、基础培养基的制备 (一)培养基的制作程序 培养基制作的一般程序：准确称量培养基的各种成分混合溶解测定及矫正pH分装、包装灭菌检定保存备用。 (二)常用培养基的种类 按培养基的作用分为： 基础培养基：含有细菌需要的最基本营养成分(蛋白胨1，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，用蒸馏水溶解)。按其性状不同可分为：(1)肉汤培养基。(2)普通琼脂培养基。分斜面和平板培
2、养基，内含23的琼脂，呈固体状。(3)半固体培养基，含0.20.5的琼脂。 营养培养基：供营养要求较高的细菌用，如血琼脂培养基(在普通琼脂培养基中加入510的脱纤维动物血)。 选择培养基：如SS琼脂培养基，可选择性抑制非病原菌生长，有利于分离病原菌。 鉴别培养基：如含铁双糖培养基，用以鉴定细菌。 厌氧培养基：如庖肉培养基，用以培养厌氧菌。 (三)基础培养基的制备过程 1、肉汤(肉浸液)培养基 牛肉、蛋白胨、氯化钠、水(蒸馏水或自来水)、NaOH溶液(1N和N10)、0.02酚红指示剂、吸管等。 取新鲜瘦牛肉，除去脂肪及筋膜，切成小块后用绞肉机绞碎，每500g碎肉加水1000ml，混合置4冰箱过
3、夜(使营养物质即溶解性蛋白质充分渗出)。 次日取出煮沸半小时左右，使肉渣蛋白质全部凝固；加热过程中不时地用玻璃棒搅拌，以免沉淀烧焦。也可不放置冰箱过夜，直接煮沸1小时。 用数层纱布过滤，弃去肉渣(肉渣中的液体应尽量挤净)，于滤液中加入1蛋白胨及0.5氯化钠，加热溶解，并补足失水至1000ml。 冷却到50在右，以N10 NaOH调至pH值7.67.8。 待pH矫正后，再加热10min，使肉汤中部分蛋白质等因加碱及再度加热而凝固沉淀。过滤并补足失水，重复矫正pH值次， 将上述制备的肉汤分装于烧瓶或试管中，瓶口或管口加塞并包扎，经103.34kPa(15磅)20min高压灭菌后，置冰箱中或干燥阴凉
4、处备用。 用作基础培养基，其营养比肉膏汤好，一般营养要求不高的细菌均可生长。 2、肉膏汤培养基 牛肉膏系将牛肉汤加热浓缩而成，每1000毫升能浓缩成肉膏约70克。牛肉膏汤可代替牛肉汤来培养细菌，由于经长时间加热，部分营养成分(如糖分)已损失，故其营养价值略低于牛肉汤。但肉膏汤制作手续简单，制品透明清晰，酸碱度变化较小，故仍常用。 牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水、氢氧化钠溶液、0.02酚红指示剂、吸管等。 将牛肉膏35g、蛋白胨10g、氯化钠5g加于1000ml水中，用玻棒搅拌使其溶解。必要时加热使其溶解。 矫正至pH7.47.6，煮沸35min，过滤。 分装于适当容器内，高压灭菌15磅20min，
5、置冰箱中或干燥阴凉处备用。 供一般细菌培养用。 3、肉汤琼脂固体培养基 琼脂是海藻糖中提取出的一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用。加入培养基的目的是使之固态化，因其熔化点为100，凝固点约40，利用此特性，加至肉汤或肉膏汤内后，趁热可制得斜面，平板等不同类型的固体培养基，以供分离培养、繁殖细菌等用。 pH7.6牛肉汤或牛肉膏汤、琼脂、空试管、灭菌培养皿(9cm直径)。 于pH 7.6的牛肉汤或牛肉膏汤中，加入23琼脂，加热溶化。 以脱脂棉过滤去除杂质(或不过滤)，分装烧瓶或试管(琼脂斜面每管5m1)。 经15磅20min高压灭菌后，趁热将装有5ml肉汤琼脂之试管斜置，待冷凝后即成琼脂斜面培
6、养基。高层琼脂的分装量约为试管长度的14或13；若接种厌氧菌则应为试管长度的23。烧瓶中肉汤琼脂冷至5060时，以无菌操作法将其倾入灭菌空培养皿中(每皿1520ml)，迅速盖上皿盖，并将培养皿于桌面轻轻回转摇动，使皿内培养基平铺皿底，待冷凝后即成琼脂平板培养基。 琼脂斜面培养基用于纯种细菌接种以保存一般菌种。 琼脂平板培养基用于细菌的分离培养。 4、肉汤琼脂半固体培养基 pH7.6的牛肉汤或牛肉膏汤、琼脂、空小试管(10100mm)。 于pH7.6的牛肉汤或牛肉膏汤中，加入0.30.5琼脂，加热溶化后，过滤并补足失水。 分装于小试管中，每管3ml，经15磅20min高压灭菌后直立冷凝即成。 常
7、用于细菌的动力检查和菌种保存。 5、干燥培养基 干燥培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾、真空、低温、蒸发等干燥方法，将培养基内水分去掉后形成各种固形成分，经过适当处理使成干燥粉末状。用时只要按一定比例加入一定量的蒸馏水，经过溶解、分装、高压灭菌即可应用。其优点是节省时间、使用方便。 二、细菌的接种法 (一)分离培养法 细菌种类多且分布广，因此临床标本如粪便、痰、脓等以及水、牛乳中常含有多种细菌。应用分离培养法可获得检材中某一种细菌，亦可使被污染的菌种重新分纯。 葡萄球菌和大肠埃希菌的混合菌液、普通琼脂平板。 当标本中含有两种以上细菌时，可用平板划线接种法。划线方法很多，平板分离划线接种为常用
8、的分离培养法，最后均使混杂的细菌在琼脂平板表面分散，形成菌苔；或者使单个细菌固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落而得到纯种细菌。操作方法：右手持接种环，火焰灭菌后，挑取待分离标本一环；左手持琼脂平板，以左手拇指和食指将平板盖开启，右手将沾有检材之接种环伸入平板，与平板培养基表面成45角，如图所示，在培养基表面分区划线(每区划线后，接种环都须经火焰灭菌)，盖好平板。最后接种环火焰灭菌；在平板底上标好组别、姓名、日期等(标签纸写好后贴上)。将平板底朝上、盖朝下放入37温箱中培养，24小时后观察结果。 平板划线接种法 观察琼脂平板培养基表面菌苔以及单个菌落生长情况，即观察琼脂平板培养基表面单个菌落的大
9、小、形状、突起、边缘、菌落表面、湿润度、透明度及颜色等性状。挑取单个菌落可获得纯培养。 (二)纯种细菌培养法 各种检材经分离培养得纯种细菌后，若需保留菌种或进一步测试其生化反应等生物学特性时，必须进行纯种细菌培养。根据常用培养基的物理性状，纯种细菌培养接种法有以下几种。 1、琼脂斜面培养基接种法 凡具有斜面外形的的固体培养基均采用此种方法接种细菌。 琼脂斜面培养基、大肠埃希菌琼脂斜面1824小时培养物。 右手持接种环，火焰灭菌后，在琼脂板上挑取单个典型可疑菌落少许； 左手持斜面培养基试管，右手掌和小指拨出棉塞，将挑有细菌的接种环伸入试管内。 在培养基表面划线后，塞好棉塞，接种环火焰灭菌；放入3
10、7孵育24小时后观察。 预先在试管1/3处标好组别、姓名、日期等。 琼脂斜面接种法 观察斜面表面菌苔生长情况。 2、半固体培养基接种法 半固体琼脂培养基、醋酸铅培养基及明胶培养基等均用本法接种细菌。 半固体琼脂培养基、痢疾志贺菌及大肠埃希菌斜面培养物。 右手持接种针，火焰灭菌后，挑取菌落或菌苔少许，垂直刺入半固体培养基的中央，深入管内培养基的3/4处，再循原穿刺线退出。放入37孵育24小时后观察。 观察细菌能否运动。有鞭毛菌能运动，细菌沿穿刺线扩散生长，使培养基呈毛玻璃样混浊；而无鞭毛菌则不能运动，细菌沿穿刺线生长，其周围培养基仍为原来的透明度。 液体培养基、半固体培养基接种法 3、液体培养基
11、接种法 肉汤、葡萄糖蛋白胨水及各种单糖发酵管等液体培养基都用本法接种细菌。材料为普通肉汤培养基、大肠埃希菌琼脂斜面1824小时培养物。 右手持接种环，火焰灭菌后，用接种环挑取菌落少许，如图所示，在接近培养基液面的管壁上轻磨后，竖直试管，使接种的细菌混入培养液(图9-3A)。 各种培养基接种细菌后，即放入37温箱中培养24小时，观察结果。 细菌生长情况：均匀混浊、菌膜、沉淀。 (三)细菌在培养基中生长现象 1、细菌在液体培养基中生长现象，观察结果并填入下图。 细菌在液体培养基中生长现象 2、细菌在平板培养基上生长现象，观察结果并填入图9-1。 细菌在 区生长最多，形成 ，在 区生长最少，可见单个
12、 。 3、细菌在半固体培养基中生长现象，观察结果并填入图。 本法为检查细菌动力的试验，凡细菌沿穿刺线向周围扩散生长者，说明该菌有鞭毛，为动力试验阳性，只沿穿刺线生长为阴性。 细菌在半固体培养基中生长现象 三、细菌分解代谢产物检查 细菌的新陈代谢受一系列酶的控制，各种细菌又具有各自独特的酶系统，因而在代谢过程中所产生的分解和合成代谢产物也不相同，这些代谢产物又各具有不同的生化特点。根据此特点，利用生物化学方法来鉴别不同的细菌称为细菌的生化反应。这些试验在鉴别和鉴定细菌方面起着重要作用。 (一)糖发酵试验 各种细菌因含有发酵不同糖类的酶，因而分解各种糖(醇)类的能力各不相同。有些能分解糖(醇)产酸
13、，使指示剂变色，有些能产酸产气，有些则不能分解。据此可鉴别细菌的种类。 糖发酵管是将葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇或蔗糖等加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓度为0.751，并加入一定量的溴甲酚紫指示剂和1支倒置的小管，管内液体为紫色。接种细菌经37孵育，细菌分解糖后，若产酸，则使培养基变色。其颜色由所加指示剂而定，如指示剂为溴甲酚紫，则由紫色(碱性)变成黄色(酸性)；如为酚红，则由红色变成黄色。一般以“”表示产酸；若产酸、产气，不仅培养基变色，而且倒置小管内出现气泡，以“”表示；若不分解该种糖，则无以上两种现象，以“”表示。 葡萄糖发酵管(乳糖)、产碱杆菌、伤寒沙门菌及大肠埃希菌斜面培养物。 分别
14、将产碱杆菌，伤寒沙门菌及大肠埃希菌接种于葡萄糖发酵管中，置37孵箱中培养1824小时。 产碱杆菌不分解葡萄糖()；伤寒杆菌分解该糖产酸不产气()；大肠埃希菌则产酸产气()。 (二)吲哚(靛基质)试验(Indol试验) 某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚(靛基质)，吲哚本身无色，不能直接察见，加入吲哚试剂(对二甲基氨基苯甲醛)则形成红色的玫瑰吲哚，易被肉眼察见。 蛋白胨水培养基、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌1824小时斜面培养物、吲哚试剂。 分别接种大肠埃希菌及乙型副伤寒沙门菌于蛋白胨水培养基中。37孵育2448小时。 沿管壁各加入吲哚试剂05ml，约隔1min左右，在二层液
15、面交界处如出现一圈玫瑰红色，即为吲哚试验阳性，若不出现红色，则为吲哚试验阴性。 硫化氢试验 某些细菌能分解培养基中的胱氨酸等含硫氨基酸，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐(或铁盐)则形成黑褐色的硫化铅(或硫化铁)沉淀物。黑褐色沉淀物愈多，表示形成的硫化氢量亦愈多。硫化氢试验用的培养基中含有硫代硫酸钠，能保持还原环境，使形成的硫化氢不再被氧化。 醋酸铅培养基、大肠埃希菌及变形杆菌1824小时琼脂斜面培养物。 分别接种(穿刺法)大肠埃希菌及变形杆菌于醋酸铅培养基中。37孵育24小时。 穿刺部位呈黑褐色者为阳性，不变颜色者为阴性。 细菌生化反应结果 生化反葡萄糖 乳 糖 靛基质 应 菌种 大肠埃希菌 硫化氢 1.常用培养基的种类及用途如何? 2.纯种细菌培养法有几种？如何观察各种培养基中细菌的生长结果？ 3.糖发酵试验、吲哚试验、硫化氢试验的原理及其意义如何?
