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1、小鼠精巢细胞减数分裂本的制备与观察细胞生物学实验 小鼠细胞分裂标本的制备与观察 一、 实验目的 a) 掌握小鼠精巢染色体标本制作法。 b) 观察减数分裂过程中不同时期的染色体。 c) 观察腹水瘤细胞有丝分裂中不同时期的染色体形态。 二、 实验原理 a) 减数分裂是发生于生殖细胞的一种特殊的细胞分裂方式，DNA复制一次，而细胞连续分裂两次，形成单倍体的精子和卵子。减数分裂远比有丝分裂复杂，经两次细胞分裂，分别称减数分裂、减数分裂，两次分裂间又一个较短的间期，这个间期DNA不复制。 b) 雄性动物精子发生于睾丸曲精细管的生精上皮细胞，由其中的精原细胞经多次有丝分裂和生长，形成初级精母细胞，初级精母
2、细胞经减数分裂形成次级精母细胞，次级精母细胞有丝分裂成精细胞，再经一系列变化成精子。 c) 因此，通过分离曲细精管、剪碎并加入液体吹打，可使官腔各种细胞游离出来，然后经过低渗、固定、染色等过程就可制成包含减数分裂各期的标本。 三、 实验试剂及仪器 a) 材料：成年雄性小白鼠 b) 用品：注射器、平皿、尖头镊子、剪刀、吸管、离心管、离心机、玻片等。 c) 试剂：1、100mg/ml秋水仙素。 2 、2柠檬酸钠溶液 3、 0.075M的KCI 4、3:1甲醇:冰醋酸及1:1甲醇:冰醋酸 5、PH6.8，0.01M的PBS缓冲液 6、Gimesa原液 7、Gimesa工作液：1份Gimesa原液加9
3、份PH6.8，0.01M的PBS缓冲液，混匀。工作液应现用现稀释。 四、 实验步骤 a) 细胞收集 i. 小鼠精巢细胞收集 1. 注射秋水仙素，增加中期分裂相。 (试验前45小时，小鼠腹腔注射秋水仙素0.5ml。 2. 取睾丸并清洗。 断颈处死小鼠，剖开腹部，取出肾形睾丸，放入盛有45 ml2柠檬酸钠溶液的平皿中，洗去污血，去掉胞外脂肪等物。 3. 挑出曲细精管并剪碎。弃污液，另加柠檬酸钠溶液1 ml，用尖头镊尖将曲细精管拉出，并用眼科剪尽量将其剪碎。 1 细胞生物学实验 4. 游离并收集细胞。将剪碎的曲细精管及溶液移入离心管中，用吸管反复吸打12min，使尽量多的细胞从管腔中游离出来；静置5
4、 min，使大的膜管状杂质下沉；吸含有游离细胞的上清液于另一管中，1000 rpm离心5 min，沉淀即为不同发育阶段的细胞。 ii. 小动物骨髓细胞收集 1. 处死动物，取长骨。 2. 用剪刀剔除骨上所附肌肉及其他组织。 3. 用剪刀剪开骨头两端。 4. 用带针头的注射器吸取生理盐水将骨髓腔中细胞冲到小烧杯或小平皿中，在转入离心管中。 b) 细胞染色体标本制备 i. 低渗处理，使细胞胀大,加入5 ml 0.075M的KCI，轻轻吹打混匀，静置10 min。 ii. 预固定. 向离心管中加入1ml 3:1甲醇:冰醋酸，轻轻吹打混匀，静置2 min，1000 rpm离心8min，弃上清。 iii
5、. 固定. 向上述沉淀中加入5 ml 3:1甲醇:冰醋酸，吹打混匀，静置1020 min，1000 rpm离心8min，弃上清。 iv. 再固定 加5 ml 1:1甲醇:冰醋酸，吹打混匀，静置5 min，1000 rpm离心8min，弃上清，加2-3滴1:1甲醇:冰醋酸固定液悬浮细胞。(有残余液就直接滴片，不用另加固定液） v. 滴片。 滴一滴细胞悬液于冰水中刚捞出的湿载波片上，自然干燥。 vi. 染色。 Gimesa染液20-30 min,流水洗去多余染液，待干 五、 实验结果 a) 腹水瘤细胞湿片观察 上图当中，圆圈1内的为腹水瘤细胞分裂后期的染色体形态。此时的染色体较中期细，切此时的染色
6、体不规侧，如图所示染色体基本分为两个2 细胞生物学实验 区域。 圆圈2内的为腹水瘤细胞为分裂前期的染色体形态。圆圈3内的腹水瘤细胞为分裂间期的染色体形态。分列前期与分裂间期的染色体形态的区别为：分裂间期的细胞核内的染色质分布均匀，颜色均匀；分列前期的时间比较长，所以染色体的形态也比较多种，有细胞核膜还存在的，但其中的颜色不均匀，还有细胞核膜已经解体的，但染色体比较凌乱，且比较紧密。 如图所示，圆圈1中所示的为腹水瘤细胞有丝分裂中期的染色体形态。此时，染色体排列的较有规律，而且染色体也比较粗。这个时期比较容易辨认，而且就观察所得，处于中期的细胞数量也比较多。 3 细胞生物学实验 如图所示，圆圈1
7、内的细胞可能为腹水瘤细胞有丝分裂末期的细胞。 b) 腹水瘤细胞干片观察 如图所示，为腹水瘤细胞有丝分裂的干片观察。装片当中，细胞膜破裂的极少，只有少数细胞细胞膜破裂，可以看到里面的染色体，图中可以看到的染色体基本处于细胞分裂中期，因为细胞分裂中期也是最容易观察的。 c) 精巢细胞的减数分裂观察中的形态基本相同的前期、中期等的染色体形态就不再赘述，主要来看一下精巢细胞所特有的染色体及细胞形态） 如图所示，圆圈1当中的精巢细胞已经完成了减数分裂，但是细胞质的分裂还没有完成。下拨之分裂完成以后及形成精细胞，在经过形态变化即可形成精子。图中可见清晰的细胞膜、核膜以及染成深色的染色体。圆圈2当中蝌蚪形的
8、深色物质为细胞膜裂解后暴露在外面的精巢细胞的核。 4 细胞生物学实验 图片拍的不是非常的清晰，但是可以看出上图所有完整的细胞但中都有两个被染成了深色的核，触不可以判断该细胞正处于减数第一次分裂的末期。 六、 实验分析 a) 实验中各种试剂的作用：100mg/ml秋水仙素，用于促进细胞分裂。2柠檬酸钠溶液，用于对细胞进行清洗。0.075M的KCI，用于细胞的膨大，且因为浓度控制的刚好，所以细胞又不会破裂。3:1甲醇:冰醋酸及1:1甲醇:冰醋酸，用于固定细胞。Gimesa原液，用于染色。 b) 试验中腹水瘤细胞的观察分为干片和湿片。湿片是将细胞悬液滴在已经预先放在冰水当中湿润过的载玻片，使细胞破裂；而干片上的细胞基本上不破裂。 七、 注意事项 a) 收集尽量多的细胞。 b) 加入低渗液后一定要轻轻吹打，以免细胞核提前破裂，引起染色体外遗，无规则排列。 c) 染色要扣染，以免染液在玻片表面形成氧化膜，影响观察。 5
