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1、常见提取总DNA,RNA的方法与注意事项提RNA，可是电泳后什么条带都没有，用的是REDzol，是因为细胞太少了还是别的什么原因，在加了氯仿后没有出现3层，只有沉淀和上清，是不是因为加氯仿到离心隔的时间太久了？ 参考见解： 1、 样品量太小； 2、 操作时没有严格按照提RNA的要求做，一般需要带手套，最好带上口罩，所有塑料用品需要用DEPC处理并高压，要在超净台上操作，尽量不让外源的RNA酶降解RNA。 3、 RNA电泳的电泳液和胶必须现配现用，并且要用DEPC处理，电泳槽、制胶板先用蒸馏水洗涤然后用75的酒精处理，还有，要单独一个槽子跑，不要和其他胶一起跑。跑胶时间控制在10分钟左右。 4、
2、 在加了氯仿后没有出现3层，只有沉淀和上清，可能是加的氯仿量不合适，一般是按0.2ml氯仿/mlTrizol加氯仿的。从加氯仿到离心隔的时间对这个应该没有影响。 5、 在提完RNA后可以测OD值，如果OD值在1.8-2.0之间，说明提的RNA比较纯。 RNA提取可不可以不用DEPC处理，多次灭菌也可以比较有效地灭活RNAse，这种方法确实可行吗？ 参考见解：DEPC主要目的是防止RNA酶,其实还有很多其他的方法处理器皿的,如氯仿冲洗,NaOH处理,高温烘烤等另外两次灭菌也可以代替DEPC处理.提RNA的关键在于：防止内源性或外源性RNase降解RNA对付外源性RNase有两种办法：能烤者烤，能
3、泡者泡。比起其他的核酸实验来说，就多这么一步。其二、RNase分子内部存在二硫键，一般条件变性后很快即可复性，所以极为稳定；而且其作用条件“简单、快捷”与绝大多数DNase不同，不需要二价阳离子即可迅速发挥酶切作用。所以，要想长期保存RNA标本，DEPC处理溶液、Tip头等都是必不可少的。RNase一般高压不能灭活，如果不用DEPC的话，快速提取，快速使用，不能贮藏。 3个关于乙醇单词：ethanol；alcohol；mercaptoethanol，他们的主要区别是什么，可以互相代替吗？ 参考见解：ethanol是乙醇的专业名词，是用在医学，工业等方面，主要是指工业酒精。alcohol也是乙醇
4、，酒精的意思，但是主要是用在饮食行业的名词。mercaptoethanol 是巯基乙醇，不同于前两种，是另外一种物质，是一种还原剂。 RNA提取中DNA是怎么去掉的？在哪一步呢？ 参考见解：在加入氯仿离心吸取上清的时候，注意不要吸到中间层。一般都要用DNase处理，即使吸不到中间层，也可能有DNA污染。 组织已经低温保存了一年多了，用来提RNA可以吗？ 参考见解：液氮中保存应该可以，但如果是在-70C低温冰箱中则可能降解，建议在液氮中保存时尽量将组织块切小，最好直径在1CM之内，有利于保存并方便下一步RNA提取操作。当然如果条件允许，可以将组织块放入RNAlater后低温保存，只要普通冰箱即可
5、，方便且效果很好。 提取血细胞的RNA，但血凝很快，应该注意什么问题？是不是要加EDTA？用什么方法会更好？ 参考见解： 全血提DNA或RNA要用抗凝血，可以用医院里采血管，里面已经加了抗凝剂，或是自己配EDTA、ACD等来抗凝。EDTA抗凝用2.5%的溶液，与血液之间体积比一般是1:10 。 ACD配方：单结晶水柠檬酸 8.0g，柠檬酸三钠 22.0g，单结晶水D-葡萄糖 24.5g，顺次溶于蒸馏水中，定容至1000ml，过滤除菌。分装后20C保存。抗凝血要用淋巴细胞分离液分离，得到单核细胞后，再加入trizol等提取RNA，步骤可按试剂盒操作进行。如果不分离单核细胞，血里面的红细胞对提取有
6、影响，把红细胞破坏掉也可以。 采用淋巴细胞分离液分离外周血中的有核细胞，经细胞裂解液处理，上清提取RNA，沉淀提取 DNA，用分离液分离所得红细胞沉淀制备血红蛋白溶液。本法能从少量外周血中同时分离 RNA、DNA 及血红蛋白，高效易操作，值得推广。 怎样能更有效的降低材料的降解？ 参考见解： 1、 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如?果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。 2、 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研
7、碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 3、 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。 4、 外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。 5、 内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。 OD260/O
8、D280比值偏低？ 参考见解： 1、 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。 2、 苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 3、 多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。 4、 设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。 RNA提取得率低？ 参考见解： 1、 该组织或者细胞中RNA含量偏低：不同细胞和组织中RNA的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4g/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2g/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量0.05g/mg)。
