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1、法合成目的cDNA小论文3 在构建基因工程菌时，用逆转录-聚合酶链反应法合成目的cDNA过程中你认为可能会遇到的那些情况？如何进行处理？ RT-PCR是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、O
2、ligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。 RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒反转录酶。 RNA的反转录过程遇到的问题 1 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。 2 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。 3 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD、-Actin等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中
3、扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。 4 PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。 5 防止DNA的污染： 采用DNA酶处理RNA样品。 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。 一、RNA制备 模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有
4、的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换 二、cDNA第一链的合成 所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。 AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。 三、
5、cDNA第二链的合成 合成的单链cDNA 3端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。 四、cDNA的分子 已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端
6、转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA也可以经PCR扩增后再入适当载体。 RT-PCR RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。 cDNA产量的
7、很低 可能的原因： *RNA模板质量低*对mRNA浓度估计过高*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足*同位素磷32过期*反应体积过大，不应超过50l 2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅 *最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系*与反应起始时RNA的总量及纯度有关*建议在试验中加入对照RNA*第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SS反转录酶无法从此引物进行有效延伸
8、。*目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：a. 将第一链的反应温度提高至50。b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。 3. 产生非特异性条带 *用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。 4. 产生弥散条带 *在PCR反应体系中第一链产物的含量过
9、高*减少引物的用量*优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数*在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。 5. 产生大分子量的弥散条带 *大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的*对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10 6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果 *通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。*有可能是引物二聚体的条
10、带 7. 扩增产物滞留在加样孔中 *有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。*另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。 8. SS与SS有何不同？ *具有更高的热稳定性*具有更长的半衰期*对PCR无抑制*干冰运输*Tdt活性更低 9. 为什么有人更喜欢用SS而不是ThermoScript？ ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低，SS则更稳定。 10. 为什么使用基因特异性引物？ GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建
11、议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。 11. 什么情况下需要使用RNase H？ 在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时 12. 根据不同的目的选择不同的系统：RT与PCR使用不同的引物或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统 高灵敏度 一步法或两步法RT-PCR系统 高特异性 含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统 高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果含Elongase酶的一步法RT-PCR系统
