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1、瑞氏吉姆萨复合染色液外周血涂片的制作方法 1、采血：胶头滴管吸取血液，血液直接滴加到洗净烘干并且硅化过的载玻片的一头。 2、推片：将推片的平齐端置载玻片上血滴的稍前方，将推片略向后移使与血液相接触，血液遂于推片与载玻片的夹角间散开。以约30度的夹角向前均匀地推动推片即可制成血涂片。其薄厚度要适中，分布均匀而无空泡，边缘整齐。 3、固定：推片做好后，涂片后潮干固定，以免细胞漂落太多，影响制片质量， 甲醇固定液固定：涂片直接浸入固定液内，因固定液充足，固定效果较好。但细胞易脱落而发生交叉污染，因此应该分瓶固定，固定液回收时应过滤。多数标本用此法固定，固定时间15-30分钟。 4、染色：瑞氏-基姆萨
2、双染 1）从固定缸里取出载片后，在室温下通风晾干。将载片平放在玻璃板上准备染色。 2）所用的两种染料事先过滤好 3）将染料滴加到载玻片上以后，让其均匀覆盖住载片上的血细胞，染色时间约为2到3分钟。等瑞氏染液有变红的趋势时，迅速滴加与瑞氏染液等量的PBS溶液。继续染色2到3分钟。 4）染色时间到后，用PBS溶液冲片，小股水流，防止将大量的细胞从载片上冲落下来从而影响以后的观察。冲片结束后将载片放到阴凉处风干。 5）在玻璃板上放好牙签，将风干的载片倒扣在一根牙签上，从背面滴加基姆萨染液进行扣染。染色时间约为10分钟。时间到后用蒸馏水冲片，洗净染液后常温下风干。 5、封片：中性树胶封片，制作成永久涂
3、片。 6、显微观察：将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体、尾交界处的血细胞。在显微镜下，成熟红细胞染成粉红色；血小板染成紫色；中性粒细胞胞质染成粉红色，含紫红色颗粒；嗜酸性粒细胞含大的桔黄色颗粒；嗜碱性粒细胞胞质含有大量深紫蓝色颗粒；单核细胞胞质染成灰蓝色；淋巴细胞胞质染成淡蓝色。 所需材料：硅化过的载玻片，推片，甲醇瑞氏-基姆萨双染，过滤，PBS，牙签，蒸馏水，中性树胶，显微镜，吸耳球 1载玻片 使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。 2推片 选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm宽度的推片。 目的：制备厚薄适宜，分布均匀，染
4、色良好的血涂片 1 问题：细胞分布不均，染色效果差，细胞破裂等。 表1-1 涂片质量不佳及可能原因 涂片质量不佳 不规则间断和尾部太长 有空洞 白细胞和血小板尾部分布不规则 涂片太长或太短 涂片没有尾部 涂片很短 涂片没有边缘空隙 有细胞退变现象 血涂片厚 白细胞破损 瑞氏染色法：瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料,血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质. 细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。 基姆萨染色法：基姆萨染液由天青
5、，伊红组成。染色原理和结果与瑞氏染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释基姆萨液代替缓冲液，按瑞氏染色法染10min。或先用瑞氏染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。 表1-2 染色操作注意事项及操作不当的后果 操作注意事项 操作不当的后果 加染液应适量 过少则易蒸发沉淀，一旦染料沉积在血涂片上，则不易冲洗，使细胞深染不易检查。 冲洗时不能先倒掉染液，应以染料沉着在血涂片上 流水冲洗 冲洗时间不能过久 脱色 冲洗完的血涂片应立放于支架剩余水分浸泡脱色 上 染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关。染液淡、室
6、温低、细胞多则染色时间要长；反之，可减少染色时间。必要时可增加染液量或延长时间。冲洗前，应先在低倍镜下观察有核细胞是否染色清楚，核质是否分明。应该在具体实践中摸索合适的时间，特别是在更换染液时。每批染色液和缓冲液，均需试2 可能原因 推片污染、推片速度不连续、载玻片太脏 载玻片污染脂肪、油脂 制片技术差 推片角度不佳 血滴太大 血滴太小 推片太宽 固定延迟、固定时间太短、甲醇污染 血滴大、血粘度高、推片角度大、推片速度快 推片时用力过猛 染，以便掌握染色时间和加缓冲液的比例。 表1-3 染色质量不佳及可能原因 染色效可能原因 果 太蓝 涂片太厚、冲洗时间太短、中性水pH太高、染色时间太长、稀释染液重复使用、贮存染液暴露于阳光 太红 冲洗时间太长、中性水pH太低、贮存染液质量不佳、涂片干燥前加封片 太淡 染色时间太短、冲洗时间太长 纠正措施 在含1硼酸的95乙醇溶液冲洗2次，用中性水冲洗，待干镜检 规范操作。新鲜配置中性水。保证染液质量不佳 复染。应先加缓冲液，后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液 染料沉染料沉淀、染液未过滤、涂片太脏 用甲醇冲洗2次，并立即用水积 冲掉甲醇，待干后复染 蓝色背固定不当、涂片未固定贮存过久、使注意涂片的固定。使用EDTA景 用肝素抗凝剂 抗凝静脉血 40%甲醛：PBS =1:3 多聚甲醛：固体 3
