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1、单克隆抗体用于治疗存在的问题,1、单克隆抗体的特异性 由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应；2、异种抗体反应 鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应,理想的抗体药物的性质,高特异性和高亲和力（Kd=1081010L/M）对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排斥反应游离抗体不激活补体一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行 大规模培养抗体符合生物制品标准,问 题异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果靶部位摄取的量太低效应功能弱在体内被清除速度快,对 策抗体人源化改变抗体分子大小连接毒素、放射性同位素、药物抗体人源化,抗体治疗存
2、在的问题及对策,抗体药物改造的方向,抗体人源化和人源抗体制备改变抗体分子大小增强抗体亲和力增强抗体效应功能,单克隆抗体人源化的改进,鼠抗体人源化（人-鼠嵌合、改型抗体）小分子抗体（Fab、单链、单域、超变区多肽）基因工程抗体（双特异、免疫黏连素、催化抗体）人源抗体（噬菌体抗体库、转基因小鼠）人-人抗体,1、抗体人源化鼠单克隆抗体人源化：嵌合抗体、改型抗体小分子抗体：单价(Fab、ScFv、单域抗体、超变区多肽)、多价（Di-,Tri-,Minibody）特殊类型抗体(双特异性抗体、细胞内抗体、抗原化抗体、免疫脂质体)抗体融合蛋白（免疫粘连素、免疫毒素、催 化抗体）,VH和VL是抗原决定簇结合位
3、点 高变区 HVR 决定簇互补区CDR 骨架区FRCH1和CL：Ig同种异型的遗传标志CH2：补体结合位点 CH3：某些细胞Fc受体结合部位,第一代的抗体人源化嵌合抗体 从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的免疫排斥反应。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。,Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL,免疫球蛋白基因载体的构建,H链嵌合载体,L
4、链嵌合载体,共转染细胞,启动子,人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略,鼠VH,鼠V L,人CL,人CH,抗体分泌细胞,人-鼠嵌合基因工程抗体,第二代的抗体人源化改型抗体,在嵌合抗体的基础上进一步将鼠MAb可变区中相对保守的FR(framework region)替换成人的FR，保留与抗原结合部位决定簇互补区（complement determinant region)部位(即CDR移植)早期的改型抗体：简单的CDR移植，通过点突变进行微调即更换某个位点上的氨基酸。,第二代改型抗体：应用了人抗体基因库；引进计算机技术模拟抗体分子的立体结构(分子模拟法)；使用了鼠人嵌合FR。其目的是获得具有高亲和力的治
5、疗性抗体,CDR序列,CDR序列,鼠单克隆抗体,人抗体,人源化抗体,鼠单克隆V区人源化（CDR移植）,小分子抗体 人源化抗体属完全的抗体分子。通过基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性的基础上，把完整的抗体分子改造成较小的分子，称为小分子抗体。根据其价数的不同可分为单价小分子抗体及多价小分子抗体两种。,单价小分子抗体一、Fab抗体Fab段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体只有完整IgG的1/3。,二、单链抗体(ScFv)定义：用基因工程方法，将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，功能：具有较好的抗原
6、结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件。,ScFv应用：用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 研究基因结构与功能的关系,三、单域抗体 抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定，因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或 VL一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的112，故也称之为小抗体。,四.超变区多肽(hypervariable region polypeptides)抗体抗原结合是经过补体决定区（CDR
7、）来实现。因此，CDR是构成抗原抗体结合的最小结构单位。根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimal recognition unit,MRU)。,多价小分子抗体 在ScFv的基础上，可以把两个或两个以上的ScFv重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。其中包括双链抗体(diabody)，微型抗体（minibody），三链抗体(triabody)及四链抗体(tetrabody)等。,一、双链抗体(diabody)制备方
8、法 化学交联法 粘性蛋白结构域融合法 接头长度控制法。,二、三链抗体(triabody)在制备单链抗体时，当接头的长度为2个或2个的以下氨基酸残基时，或者直接把VH结构域的N末端与VL结构域的C末端相连，通过非共价键而形成的三聚体，称为三链抗体。接头长度在312个氨基酸残基时，则形成双链抗体。,三、微型抗体(minibody),通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗体(VL-VH)的VH结构域与IgG的CH3结构域融合，形成VL-VH-CH3的结构，称之为微型抗体（minibody）。此种抗体合成后通过CH3结构域形成稳定二聚体式，发挥其双价微抗作用。,四、双特异性抗体（BfAb）天然Ig是由
9、两个完全相同的VL和VH区域构成，该区域是特异性识别并结合抗原的关键部位。而经人工设计构建的双特异性抗体（BsAb）则由两个不同的抗原结合位点组成，可同时与两种不同的抗原决定簇结合，并可将其偶连的药物、酶或放射性核素等导向到靶部位，这种具有双价双特异性的抗体又称为双功能抗体（bifunctional antibody,BfAb）,双特异性抗体的特点将免疫细胞锚着于肿瘤部位，提高肿瘤部位的效靶比。不受MHC的限制，直接激活免疫细胞的杀瘤机制。,1,2,3,提高抗体效应功能,抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的具有新的特性融合蛋白。根据构建方式的不同，主要分为两种形式：Fc融合蛋白
10、（Fc fusion protein,FcFP）由抗体的Fc 段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。如CD4免疫粘附素，就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的Ig同源区重组而成抗原结合融合蛋白（antigen-Binding fusion protein,ABFP）由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。,免疫粘附素(immunoadhension)：将人抗体恒定区(主要是Fc段)N-端连接于人细胞表面的受体分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分子，这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其它相应的效应功能
11、，这种分子又被称为新效能抗体。免疫毒素：又称生物导弹，是由导向性的载体分子与具有毒性的弹头蛋白交联而制成，属于导向药物的一种。,偶连细胞毒物质,连接放射性同位素(131I、99mTc）连接植物或细菌毒素（ricin、PE40）连接细胞毒性药物（C1027、柔红霉素）,免疫毒素,C,C,V,C,V,C,C,C,SPDP,SPDP,Ricin A,Ricin A,（-FcRI-Ricin A）,Ricin A:蓖麻毒素A,对肿瘤细胞具有毒性作用,CH1,CH2,CH3,IL-2,scFv,IL-2,免疫细胞因子(Immunocytokine),五、细胞内抗体 细胞内抗体主要是指在细胞内合成并作用于
12、细胞内组分的抗体，亦称内抗体（intrabody）。目前的研究主要集中在单链抗体上，在ScFv的C端或N端插入其它靶向信号（targeting signals），如分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号和内质网滞留信号等，从而进行检测、识别、发挥特定功能。,细胞内抗体的应用：由于细胞内抗体具有高亲和力及选择结合特性，因而可通过多种机制调控细胞的生理过程及代谢。作用机理表现为：阻断靶蛋白的活性部位阻断细胞内蛋白蛋白相互作用干扰细胞内靶蛋白的转运促使靶蛋白降解,六、抗原化抗体（antigenized antibody,AbAg）AbAg是应用基因工程技术，把编码蛋白质抗原表位的核苷酸片段插入重链CD
13、R3序列中进行表达，从而产生具有天然抗原表位构象和免疫原性的新型抗体。,今后抗体药物发展的方向,寻找新的靶抗原基于抗原立体结构设计抗体基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗体模拟物,最理想的单克隆抗体,100%人源人类免疫系统自然产生,25年来的全人抗体的尝试,鼠骨髓瘤不适合与人B细胞融合稳定性差抗体产量低 非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)保存抗体分泌细胞细胞株不稳定抗体的产量低不能特异性地保存抗体分泌细胞很难获得人类骨髓瘤细胞株,成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体进入新的里程,用 途：能稳定的保持人B细胞分泌抗体的能力发明人：英国剑桥大学的Dr Karpas教授意 义：1 在整体水平上研究人类产生抗体
14、 2 开创人类抗体基因组学的研究评 价：1 诺贝尔奖得主Dr Milstein 推荐发表在PNAS 2 世界权威杂志“科学”发表了新闻评述 3 剑桥大学开了新闻发布会,未来单抗开发的完美方案,从已知治疗靶子生产高亲和力全人抗体全人抗体挑战靶分子的筛选开发未知抗原的治疗用抗体,41,已批准上市的单抗,42,43,正在进行临床开发中的基因工程抗体,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,武汉生物制品研究所研制的注射用鼠源性抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体是国内自行研制最早批准上市的抗体；北京百泰生物与古巴合作开发的I类癌症治疗新药“重组人源化抗人表皮生长因子
15、受体单克隆抗体”(商品名：泰欣生)是我国批准的第一个人源化单克隆抗体药物；,57,第四军医大学、成都华神联合研制的美妥昔单抗注射液(商品名：利卡汀)是全球第一个用于治疗原发性肝癌的药物，也是我国第一个具有自主知识产权的抗体类药物。,噬菌体展示系统,Phage on display,Exponential growth in publications referring to phage display.The number of Medline citations containing the terms phageand display are plotted against the yea
16、r of publication.TIBTECH NOVEMBER 1999(VOL 17).,Of Needles and Haystacks,噬菌体展示系统Phage on display,噬菌体展示原理 噬菌体展示定义、分类 简介噬菌体及淘选过程噬菌体展示应用商业化噬菌体展示系统,表型 基因型,展示肽 编码基因,什么是噬菌体展示,是一项筛选技术，将 外源多肽或蛋白 与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的 DNA 则位于病毒粒子内。,使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。,
17、Smith 在 1985 年首次证实外源 DNA 可以插入丝状噬菌体基因 III 中，并与 pIII 蛋白融合展示。Smith GP.Science 1985;228:1315-7,噬菌体展示技术,Phage Display Technology,What can be displayed?Proteins from 6-300 aaShort peptidesAntibody fragmentscDNA libraryenzymes,5Pan eluted phage,2004 Montarop Yamabhai,Cell Free,展示系统Display SystemPhage Displ
18、ayCell BasedCell Surface Display,Ribosome DisplaymRNA Display,根据噬菌体不同,根据载体不同,根据文库不同,Phage,Library,噬菌体展示系统的分类Classification of phage display systems,根据载体不同VectorTrue PhagePhagemid,根据噬菌体不同PhageM13,f1,fdT7,T4,lamda,根据文库不同Library随机肽库cDNA文库,抗体文库蛋白质文库Schematic representation of M13 PhageSchematic represen
19、tation of T7 Phage,种为结构蛋白质。与展示密切相关的有两种结构蛋白质。DNA在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬菌体颗粒。,M13噬菌体的组成和结构Structure of M13 filamentous phage丝状噬菌体：M13、f1和fd。单链DNA病毒,6407 bp。基因组编码11种蛋白质，其中5,Schematic representation of M13 Phage,Life Cycle of M13,pIII蛋白结合于 E.Coli 的F,纤毛;,细菌的Tol蛋白复合体解聚噬菌体的衣壳蛋白，转运至胞浆（再用）;,病毒ssDNA进入
20、细菌的胞浆合,成dsDNA；,以dsDNA为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNA。,第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中（37 oC）。感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体。,次要衣壳蛋白pIII,BRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND PROTEOMICS.VOL 1.NO 2.189203.JULY 2002,406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌体的尾部。由三个功能区组成：,N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上的TolA蛋白；,与噬菌体的入侵有关。,N2 受体结合 区：负责结合F菌毛。,CT 疏水区：组装
21、前黏附在细菌内膜上；与噬菌,体组装终止有关。,G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个,功能域之间的灵活性。,Infection of E.coli by Ff baceriophage,主要衣壳蛋白pVIII,每个病毒子含约2700个拷贝，约10%能有效地融合外源多肽或蛋白。,以pIII融合子方式表达的多肽是低价的，而以pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子200个拷贝）。,这种高价pVIII展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。,所有Ph.D.文库都是pIII融合方式（每个病毒子展示5个拷贝的外源多肽）
22、。,Smith et al.(1997)Chem.Rev.97,391-410,phagemid vectors,Types of phage displaysystempVIII 展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装。pIII只要不影响感染，可以展示300 aa的多肽。噬菌质粒能展示的蛋白已经达到86 kDa。,噬菌体质粒方便克隆、增强遗传稳定性,Phage display with phagemid vectors,噬菌体质粒特征：,携带有欲在噬菌体上融合展示的蛋白基,因，没有其他噬菌体基因。,有质粒复制起点(322 ori)和噬菌体复制,起点(f1 ori用于合成ssDNA
23、)。,有包装序列信号（packing signal）。有供筛选的抗生素标记基因。,Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需要的所有蛋白和酶（f1ori defect)。,包装后的噬菌体包含有两种不同来源的成份：噬菌体质粒和Helper phage。,多价展示？单价展示？,Polyvalent or monovalent display?,展示价位（Display valency)：噬菌体表面展示的多肽的拷贝数。展示价位不同所筛选的分子亲和力就会不同。,用噬菌体质粒时，以pIII展示为例：10%病毒展示为单价，非常少量的展示为两个拷贝，绝大多数只展示野生型pII
24、I。,The major displaying speciesis monovalent,but most,particles do not display at all.,改进 helper phage,pJuFo噬菌质粒中加入了 Jun and Fos Leu Zipper基因两个基因都以 PelB 作为 signal sequence，以 lac作为 promoter/operator。NH2-pelB+Jun Leu zipper+C-terminal domain pIII-COOHNH2-pelB+Fos Leu zipper+cDNA-product COOHJun和 Fos通过
25、二硫键形成异源二聚体,the leader in enzyme technology展示 cDNA 文库Selection from cDNA librariesCarmeri et al.Gene 1993,the leader in enzyme technology,淘选,Finding the needle in the haystack:Screeningphage display libraries,建立,噬菌体展示库,淘选,噬菌体展示库,分析克隆,the leader in enzyme technology淘选的方法亲和淘选,直接包被法淘选法：优点：简单直接。缺点：偶尔会导致配
26、体结合位点难以进入 可能是由于分子的立体封阻 或者是靶分子表面的部分变性而引起液相法：先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于亲和介质上，如：链霉亲和素包被的表面。,the leader in enzyme technology,噬菌体肽库与靶分子相互作用,洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体,将特异性结合的噬菌体洗脱下来,三轮淘选后，克隆测序,噬菌体肽库淘选示意图：亲和筛选,the leader in enzyme technology,测定抗FLAG M2单克隆抗体的抗原决定簇,对每 轮 淘选 所得到的克隆测序，结果清晰地显示核心抗原决定簇是DYKXXD
27、,其中X可以是任意氨基酸。,为 了 确 定 FLAG 抗 原 决 定 簇 序 列DYKDDDDK中哪一个氨基酸是抗体结合所必需的，将单克隆抗体包被于96孔板，对Ph.D.-7 展 示 文 库 进 行 三 轮 淘选。,the leader in enzyme technology噬菌体展示系统Phage on display,噬菌体展示原理噬菌体展示应用商业化噬菌体展示系统,the leader in enzyme technology噬菌体展示的应用,抗原表位分析制备特异性抗体制备疫苗、多价疫苗构建新型的生物催化剂如Ren et al(1997)将T4 DNA连接酶展示于T4噬菌体，所表达的融
28、合蛋白能够高效连接黏性或者平末端。有可能把催化某一代谢途径的多种酶展示到噬菌体上，制造人工的多酶复合体。或者把成百上千个酶分子的活性位点展示到同一个噬菌体颗粒上，制造superenzyme。,the leader in enzyme technology,噬菌体展示的应用,筛选酶抑制剂,是寻找抑制酶活性肽段的理想工具。,Dennis从肽库中筛选到非竞争性地抑制 F VIIa 活性的肽段。,Coagulation Cascade.A current simplified view of the,coagulation cascade initiated by the TFFVIIa comple
29、x is shown.,the leader in enzyme technology噬菌体展示的应用,蛋白质蛋白质相互作用,噬菌体cDNA文库与芯片相结合,(a)合成噬菌体cDNA文库。,(b)生物淘选。,(c)铺板，挑克隆入微孔板，,为制备芯片做准备。,General selection scheme for cDNA expression-products displayed on phagesurface.Konthur et al 2003 TARGETS Vol.2,No.6 261-270.,the leader in enzyme technology噬菌体展示的应用,噬菌体c
30、DNA文库与芯片结合,(a)淘选后的文库，制作DNA芯片。,(b)确认插入片段的种类。,(c)生物化学方法进一步确认。,Scheme for the elucidation of the complexity of enriched cDNA expression-productphage display libraries.Konthur et al 2003 TARGETS Vol.2,No.6 261-270.,the leader in enzyme technology,用病人IgE血清对6种不同的cDNA文库淘选，5轮后，挑出38,000个克隆，鉴别了233种蛋白，其中47种为已知
31、，186种是新的过敏源。,烟曲霉(Aspergillus fumigatus)已成为临床上仅次于白色念珠菌的一种重要的条件致病真菌。,草本枝孢(小麦黑霉病菌)Cladosporium herbarum,鸡腿蘑（Coprinus comatus）,皮屑牙胞菌(Malassezia furfur)花生和人肺组织,Crameri,R.et al.(2001)Tappingallergen repertoires by advancedcloning technologies.Int.Arch.Allergy Immunol.124,4347,噬菌体展示的应用应用举例,the leader in en
32、zyme technology噬菌体展示系统Phage on display,噬菌体展示原理噬菌体展示应用商业化噬菌体展示系统,the leader in enzyme technology,Commercial suppliers of phagedisplay vectors and libraries,the leader in enzyme technology,PhDTM Phage Display System,用于 PhD 中的噬菌体是 M13KE,由M13mp19衍生的溶源性噬菌体。,随机肽与次要衣壳蛋白N-端融合，经细胞膜分泌，噬菌斑模糊不透明，用有-互补的宿主菌在含Xgal
33、/IPTG的平板上可呈蓝斑。,融合蛋白表达时N端有一段信号肽前导序列，蛋白分泌后前导序列被切除，使随机七肽直接展示于成熟蛋白的N端。,the leader in enzyme technology,噬菌体展示肽库,E.coli ER2738 宿主菌,-28 gIII 测序引物（用于人工测序）-96 gIII 测序引物（用于自动测序）链霉亲和素 Streptavidin生物素,试剂盒组成,the leader in enzyme technology文库克隆载体可以买到吗？,用 来 构 建 所有这三种Ph.D.文库的载体，M13KE（#E8101S），是 可 以 购 买 到的。M13KE 是M1
34、3mp19 的 衍 生 株，其pIII 基因的5 端构建了限制性酶切位点，用户可 以 将 设 计 好 的 人 工 基 因 盒（synthetic cassette）插 入 此 处 构建自己的肽库。因为M13KE是噬菌体，而不是噬菌粒载体，所以在已加工的病毒子上所有5个拷贝的pIII蛋白均携带有展示肽序列。另外，大于20-30个氨基酸的展示多肽会影响噬菌体的感染力，所以此载体仅适合展示短的多肽。,the leader in enzyme technologyM13K07 Helper Phage,由M13衍生而来。在M13复制起始点处，插入有卡那霉素抗性基因。能在无噬菌质粒的情况下复制。当有噬菌
35、质粒时，由于噬菌质粒含有野生型M13或者f1复制起始点，因此，单链噬菌质粒的DNA会被优先包装并分泌。不能用M13KO7作为克隆载体，如果要克隆噬菌体展示库，建议使用M13KE噬菌体克隆载体。,the leader in enzyme technologyM13噬菌体与其他噬菌体比较有什么优点？,M13噬菌体为非裂解性噬菌体（溶源性），周质内组装，经细胞膜分泌，噬菌斑的形成不是由于菌体裂解而是由于细胞生长力减弱所致，因此噬菌斑是浑浊的而不是清亮的，用有-互补的宿主菌在含 Xgal/IPTG的平板上可呈 蓝斑。由于 M13噬菌体在增殖期间不裂解宿主菌。简化了噬菌体纯化步骤，只用简单的 PEG沉淀
36、方法就足以将噬菌体与其他所有污染的细胞蛋白分开。而其他用于噬菌体展示的噬菌体如：T7,T4和 Lambda噬菌体均为裂解性噬菌体，每轮淘选之间都需要花时间进行纯化，以避免淘选扩增的噬菌体污染有细胞蛋白（如：有些蛋白酶类物质会在淘选时将靶分子降解掉）。,the leader in enzyme technologyNEB的噬菌体文库能展示cDNA文库吗？,不适合于 cDNA文库展示，因为这种表达需要使目的蛋白序列在前导序列（蛋白分泌所需要的）和噬菌体包膜蛋白 pIII或 pVIII的 N端序列之间保持读码框架一致，这样产生的 M13 cDNA文库中，能有效表达的克隆会非常少。Novagen的 T
37、7 Select 噬菌体展示系统可以将 cDNA插入片段融合在包膜蛋白的 C末端，但是该系统利用的是裂解性噬菌体 T7而不是溶源性噬菌体 M13，淘选扩增的噬菌体可能会污染有细胞蛋白，故需要化更多的时间进行噬菌体的纯化。,the leader in enzyme technology,NEB提供的三种随机肽库,the leader in enzyme technology,Recombinant PhageAntibody system,用于克隆、表达和检测小鼠抗体基因,噬菌质粒-Helper phage系统抗体片段克隆于噬菌质粒与pIII蛋白融合展示在M13噬菌体表面,Helper phag
38、e-M13KO7,the leader in enzyme technology,T7Select Phage Display Systemfrom Novagen,Novagen 提供：,Display Vector,Pre-Made Libraries,the leader in enzyme technology,T7 噬菌体结构,Structure of the T7 phage particle,(Source:Novagen),裂解型噬菌体，含有双链DNA(40 kb,55 gene,3 classes)。Life cycle 30 min at 30C头部：20面体（icosah
39、edral)，,衣壳蛋白有415拷贝（capsid,protein,gene 10)，分别由60个6聚体和11个5聚体组成。尾部：连接头尾的颈圈（,connector)、1个短小的圆锥型尾部和6个尾丝。,the leader in enzyme technology,Genetic map of T7,衣壳蛋白表达受以下因素的调控：T7 RNA聚合酶,启动子10(promoter)终止子T（terminator)翻译起始因子s10,（translation initiation signals),衣壳蛋白有两种形式：,10A(344aa)和10B（397aa）T7Select载体：10B,th
40、e leader in enzyme technology,T7Select vector features,T7Select 415-1b:衣壳蛋白基因含有野生型的调控信号：10 promoter,Tterminator,and s10 translation initiation signals。,T7Select10-3b：The s10 translation initiation signal(ribosome bindingsite)was modified to produce the mid-copy vector。,T7Select1-2:10 and s10 were re
41、moved to further reduce capsid geneexpression。,the leader in enzyme technology噬菌体展示系统Phage on display,噬菌体展示原理噬菌体展示应用商业化噬菌体展示系统,the leader in enzyme technology测序模板的快速纯化,1.噬 菌 斑 扩 增，在 第 一 步 离 心 后，将 500 l含 噬 菌 体 上 清 转 入 一新鲜离心管。2.加 200 l PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置 10 min。3.离心 10 min，弃上清液。4.短暂离心，小心吸去残余上清。,5.沉 淀
42、物 彻 底 重 悬 于 100 l碘化物缓冲液中，加入 250 l乙醇。室 温 温 育 10 min。短 时 间 的室 温 温 育 使 单 链 噬 菌 体 DNA沉 淀 而 大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。6.离心 10 min，弃上清。用 70%的 乙 醇洗沉淀，短暂真空干燥。7.沉淀重悬于 30 l TE 中。,8.测序。根据测序方法的不同,适当增减模板用量。本方法非常快速，无需酚或层析，可以产生足够纯的模板进行自动双脱氧测序。,the leader in enzyme technologypIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?,丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白 pIII或 pV
43、III的 N端融合外源多肽。每个病毒子含个拷贝的 pIII蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力。而对主要包膜蛋白 pVIII来说，每个病毒子含 2700个拷贝之多，其中约 10%能有效地融合外源多肽或蛋白。这样，以 pIII融合子方式表达的多肽便是低价的（每个病毒子 15个拷贝），而以 pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子200个拷贝）。这种高价 pVIII展示所增加的亲和性有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价 pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。所有 Ph.D.文库都是 pIII融合方式（每个病毒子展示 5个拷贝的外源多肽）。,the lead
44、er in enzyme technology噬菌体展示筛选与其他文库筛选方法相比有什么优点？,能对较大库容量的文库进行快速筛选。同时由于被筛选的噬菌体库还可以在大肠杆菌中进行再扩增，从而可以进行连续多轮的迭代选择，得到高亲和力的序列。,the leader in enzyme technology简化的遗传密码表,文库的随机序列区域仅用32个密码子编码所有20种氨基酸。这使单密码子氨 基酸的 出现频 率相对 较高，同时排除了三个终止密码子中的两个。在构建该文库的菌株中，琥珀终止子TAG(*)可被Gln抑制。,the leader in enzyme technology淘选程序,D1：靶分子
45、包被聚苯乙烯培养板D2：将已稀释的噬菌体库加到培养板上，结合，清洗，洗脱。扩增，滴定。D3：完成扩增噬菌体。D4&D5：第二轮淘选，扩增噬菌体。D6：第三轮淘选，测序,the leader in enzyme technology,Ph.D.文库中的氨基酸分布,由原始文库中随机挑选 70个单插入克隆测序。所有测序的 490个密码子（70个克隆 7个随机密码子）中氨基酸分布如下：,*预期频率=该氨基酸的密码子数 32个,密码子 100%,展示肽序列中的精氨酸会干扰 pIII蛋白的分泌；因此七肽序列中含精氨酸的克隆 很难选到。,在文库增殖菌株中终止密码子 TAG被的,抑制，可以接受 Gln残基。,
46、M13无需体外包装电转化 效率高,库容量大 2.8 109M13噬菌体纯化步骤简单，可加速淘选进程可避免细胞蛋白的污染Any ligand(natural orsynthetic)随机肽库体内 筛选器官特异性多肽,the leader in enzyme technology噬菌体表面展示肽库优缺点优点：,缺点：仅适合展示小的多肽（=20 氨基酸）载体容量 1 kb；且有序列依赖性不能筛选 Natural ligand(T7 cDNA文库)不能筛选 DNA-,RNA-结合肽（用 T7载体文库可以）,精品课件！,精品课件！,the leader in enzyme technology,Landmarks of M13 phage display,1985 第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽1988 噬菌质粒系统1990 抗体片段的展示1993 展示cDNA 文库,1994/1995 研发了 phage two-hybrid 技术1996 首次体内 in vivo 淘选试验,1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体,1999 Combination of phage display with high-density arrays2001 Automated phage display selection,
