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1、肿瘤免疫学检验,概 述,肿瘤免疫学检验主要涉及肿瘤免疫学诊断和肿瘤患者免疫功能状态的评估。而目前临床上用于肿瘤免疫学诊断项目主要是肿瘤标记物检测，但目前使用肿瘤标记物都是肿瘤非特异性标记物，不仅由肿瘤细胞产生，存在肿瘤患者血液和体液中；也可以正常体细胞产生，健康者血液和体液中也会存在一定量肿瘤标记物，因此，如果将肿瘤标记物作为肿瘤诊断指标时，对临床上使用的肿瘤标记物进行生物参考区间评价和诊断性能评价就显得非常重要，本单元主要以AFP和PSA为例以达到举一反三作用。,实验一 血清AFP参考区间建立实验,实验室应为检验项目提供可靠的参考区间，才能使临床对健康普查者的检验结果作出判断，对病人检验结果
2、有大致的了解，发挥检验报告的作用。因此获得检验项目可靠的参考区间是实验室的重要任务。参考区间的评价一般包括参考区间的建立和参考区间的验证实验。,实验目的,掌握血清AFP参考区间建立实验的原理和方法学，以Modular Analytics E170自动电化学发光免疫分析系统测定AFP参考区间的建立流程为例加以说明。,实验原理,先确定AFP参考区间建立时的纳入人群的标准，选择参考个体，按该项目的检测要求收集标本并在检测系统性能良好的状态下进行AFP浓度的检测，收集检测结果，统计分析，确定化学发光免疫分析系统AFP测定的参考区间。,试剂与器材,选用与检测仪器相配套的试剂、校准品及其他辅助试剂。按照纳
3、入人群的标准，选择参考人群的新鲜血清标本。,操作步骤,根据文献和实验研究，总结对该项目检测结果产生的生物变异和分析干扰的因素，供选择参考个体时用。确定参考个体的选择原则（或排除非参考个体的原则），编写与之对应的调查表。依据调查表和其他有关记录，挑选候选的参考个体。应按照项目在临床使用的要求选择参考个体，在选择参考个体对象时，要兼顾各年龄段，同时应考虑是否有分组的必要（最常见的是分年龄组和性别组）。依据排除原则，剔去不符要求的候选对象。,将采集标本前和采集时对受检查的要求，详细告诉各个受检参考个体，做好准备，要求予以配合。规范地采集标本，做好分析前的标本预处理。按照相应规程做好标本采集、处理、运
4、送和保存，此外，还应考虑标本采集时的环境条件，标本采集者技术熟练要求和服务态度等。在良好的控制条件下，用事先指定的分析方法对标本进行检测，获得参考值结果。分析样品的检验方法应有方法学可靠性评价，测定过程有完整质量控制措施,结果计算和分析,绘制分布图，了解数据的分布特性。若数据呈高斯正态分布，或者数据经转换后亦呈高斯分布，可按士1.96S表示95数据分布范围，或者士2.58S表示99分布范围等确定参考限和参考区间。,参考对象群体值的特定百分数（通常是95）非参数和参数分析：是否正态分布确定参考范围的最小样本量随机至少120个观察对象,注意事项,为确保参考范围数据的可靠性，建议至少取120个参考值
5、数据，若还需分组统计，则每个分组应有120个数据。数据中的疑似离群点的判断，建议将疑似离群点和其相邻点的差值D和数据全距R相除，D/R若大于等于1/3考虑为离群点。若有2个或以上疑似离群点，可将最小的疑似离群点作如上处理，若都大于1/3，则所有疑似点都剔去；若都小于1/3，则保留所有数据。若有离群点被剔除后，应即将其他数据补上。若数据不呈高斯正态分布，则可用非参数法处理。最常见的是以百分位数法确定2.5和97.5位数的参考限，以此确定95参考区间。,方法评价,建立参考区间是实验室开展新的检验项目前必然要进行的一项工作，但由于其需要标本例数多，对人群的纳入标准要求严格；大多实验室参照试剂说明书、
6、教材、或其它权威资料转移为本实验室的参考区间，但需对此类选用的参考区间进行验证评审。采用简单的方法予以证实，如选取20位健康者，有90%以上的测定结果在参考区间内，即说明实验室选用的参考区间有效。,思考题,请设计建立AFP参考区间的抽样人群的纳入标准？,温州医学院 陶志华,实验二 血清PSA诊断前列腺癌的性能评价实验,PSA（前列腺特异性抗原）是一个分子量大约为34 000道尔顿的糖蛋白。在正常的、良性肥大的和恶性变的前列腺组织内以及前列腺液和精液内均可发现PSA。血清PSA作为前列腺癌诊断指标时，具有较好诊断灵敏度，但存在诊断特异度较低问题，目前，不推荐将PSA检测作为对普通人群或对无症状患
7、者的癌症筛查项目，也不应当作为判断是否存在恶性疾病的一个绝对性依据。有必要对临床使用的血清PSA诊断前列腺癌的效能进行评价。,实验目的,本实验项目是如何评价定量检测项目对疾病诊断价值。本实验以血清PSA定量测定为例，评价血清PSA对前列腺癌诊断价值。,实验原理,对选择的纳入研究对象的患者采取血液，进行PSA定量检测；对纳入研究对象的患者采取前列腺组织穿刺病理检查，将研究对象分为前列腺癌组和前列腺增生组。根据PSA定量检测结果制作ROC曲线，根据不同cutoff值，评价其诊断的的准确性（灵敏度、特异度、诊断准确度等）和有效性（阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比）。,临床诊断试验结果与
8、患病情况的关系,诊断试验分定性试验和定量试验。定性试验的结果分为阳性和阴性结果定量试验结果也可根据临床诊断截断值转化为阳性和阴性结果。,试验结果与疾病的关系,真阳性（true positive TP）假阳性（false positive FP）真阴性（true negative TN）假阴性（false negative FN）,疾病诊断的金标准,金标准（gold standard）：是指通过活检、尸检、外科手术、随访等所作出的决定性诊断。诊断试验：是指一般检查方法，具有费用低，操作方便，对病人无损害，快速等优点。,诊断试验性能评价指标,包括准确性和有效性两方面的指标：准确性的指标：灵敏度与特
9、异度等。有效性的指标：预告值和似然比等。,准确度评价指标,1.诊断灵敏度（sensitivity,Se）又称敏感度、敏感性，指在患病者中，应用该诊断试验检查得到阳性结果的百分比。反映诊断试验正确识别患病者的能力,该值愈大愈好。灵敏度 100%100%,2.诊断特异度(specificity,Sp),又称特异性，指在非某病者中，应用该试验获得阴性结果的百分比。反映正确鉴别非患者的能力，该值愈大愈好。特异度 100%100%,3.诊断准确度（accuracy，AC）,是指所有试验个体中，诊断试验能准确划分患者和非患病者的百分比。反映诊断试验正确诊断患者与非患者的能力。诊断准确度 100%100%,
10、试剂与器材,用于定量PSA检测的相应仪器与试剂。,操作步骤,确定研究对象的纳人排除标准：纳入以前列腺增生为症状就诊于本院泌尿外科的患者。排除膀胱炎症和膀胱癌患者。确定金标准：采用前列腺组织穿刺病理检查，根据病理结果将研究对象分为前列腺癌组和前列腺增生组。确定抽样方法和样本含量的确定估计：采用简单随机抽样。根据检验水准取值、患病率和允许误差的要求，计算试验所需要的病例数。,标本的采集与检测：患者均于前列腺检查前抽取非抗凝静脉血，离心5min分离血清，测定血清PSA含量。测量采用单盲原则，在未知被测标本所代表患者的确诊诊断的前提下完成所有的检测工作。,结果计算,将病理检查结果和PSA定量检测结果分
11、别输入SPSS13.0软件ROC Curve分析的state varibale应变量(二分类变量)和Test variable自变量(连续型变量)，Value of state varibale中设定二分类变量的临界点。运行结果：（1）ROC曲线,可直观地看到曲线形状;（2）area under the curve：曲线下方的面积,包括面积值,显著性分析,置信区间;（3）Coordinates of the curve：ROC曲线各点对应的灵敏度和误判率。制作的ROC曲线。,计算诊断效能评价指标：根据临床诊断需求，确定临床诊断截断值，再确定:诊断准确性评价指标 诊断灵敏度、诊断特异性和诊断特异
12、性等诊断有效性评价指标 阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似 然比等,结果计算,实验结果,根据实验结果，正确评价在本院使用PSA定量检测对前列腺癌的诊断价值？,思考题,如何保证实验过程中血清PSA定量检测结果一致性和准确性？如何制作ROC曲线？,温州医学院 陶志华,病案讨论 肿瘤免疫学检测,某患者，男，38岁。乙型肝炎病史十年，因急性黄疸收治入院，入院后当天就进行血浆置换治疗。实验室检查为：,病案讨论一,实验室检测结果,问 题,该患者初步临床诊断是什么？依据是什么？患者血清AFP结果变化如何解释？是实验室检测误差所致还是患者体内真实变化？患者血清AFP测定结果变化预示患者病情变化如何？是
13、病情恶化还是病情好转？为什么？,温州医学院 陶志华,病案讨论二,某患者，男，65月，因大便硬结，便秘，小便不畅而且次数增多而就诊，医生进行常规体检后，开了检验医嘱，检查结果为：血常规结果正常，肝功能和肾功能检查项目结果也正常，但血清总PSA为24.5 ng/ml(参考范围为 4.0 ng/ml),血清CEA为2.1 ng/ml(参考范围为 5.0 ng/ml)。行前列腺组织活检结果为：没检到前列腺癌细胞。该患者一个月后，在同一家医院检验科复查结果为：血清总PSA为3.2 ng/ml,血清CEA为1.6 ng/ml。,问 题,为什么血清总PSA检测结果不一致？第一次血清总PSA结果升高可能原因是什么？影响血清总PSA测定结果因素有哪些？该患者下步应该进行哪些检查或随访？,温州医学院 陶志华,
