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1、项目编号：（由管理部门填写）曲靖师范学院大学生创新创业训练计划建设项目申报书项目名称：基于代谢网络的小桐子脯氨酸转运蛋白基因家族的鉴定与克隆项目申报类别：创新训练口创业训练口创业实践所属一级学科名称：生物学项目负责人：吴贞莹年级:二年级学院：生物资源与食品工程学院专业:生物技术指导教师：.王海波职称:教授填表日期：2021年6月18日曲靖师范学院大学生就业创业服务中心制申请者的承诺我们自愿参加曲靖师范学院“大学生创新创业训练计划”项目的研究，在充分知晓并接受责任书相关规定的前提下，郑重承诺如下：一、严格遵守有关自然科学、社会科学（含调查报告）、科技发明与制作的行为准则和科研道德行为规范；二、恪
2、守诚信的原则，保证所有实验数据真实可靠，准确严谨，决不伪造实验数据，决不抄袭剽窃他人的论文、专利或科研成果；三、自觉遵守科技活动自身规律和科技界公认的行为准则，遵守正式承诺，履行约定义务；加强自我约束，注重道德修养，自觉维护科学的尊严与纯洁，坚决杜绝一切违背科研道德的不良行为、不当行为、失信行为和不良学术风气；四、遵守曲靖师范学院大学生创新创业训练计划建设项目实施办法，按照项目计划进行，按期实现预期目标。五、严格按照曲靖师范学院大学生创新创业训练计划建设项目实施办法的要求使用经费，不挪作他用。六、由于项目组成员原因所发生违反学术纪律、科研道德方面的问题，项目组成员愿意承担一切相应后果及法律责任
3、；七、承诺书一式三份，项目组、所在学院、创新创业学院各执一份；八、本承诺书自承诺人签字之日起生效。承诺人（项目成员亲笔签名）:年月日项目负责人身份证号码：53O1292OOOO9O3OO29指导教师（签名）:填写说明一、填写本申报书前，请先认真阅读曲靖师范学院大学生创新创业训练计划建设项目实施办法和相关通知。二、本表要按顺序逐项填写，内容要实事求是，表达要明确、严谨。空缺项要填“无”。上报的申报书一式三份要求一律用A4纸打印,于左侧装订成册。三、表格内各项内容如果不够填写，可以根据内容扩充表格。一、项目申请人情况负责人姓名吴贞莹性别女民族汉族出生日期2000.09.03所在学院生物资源与食品工
4、程学院专业、班级生物技术通讯地址云南省昆明市寻甸县电话项目名称基于代谢网络的小桐子脯氨酸转运蛋白基因家族的鉴定与克隆项目类别创新训练创业训练创业实践项目周期2年所属学科专业生物技术申请人参加科研的经历自何年月至何年月参加的项目担任的工作2021.032021.05本科实验准备实验助理2020.10至今参与教师科研项目的研究工作实验助理项目组其他成员（团队2-5人，不包括负责人和指导教师）姓名性别年级所在学院专业分工签名孙春燕女二年级生物资源与食品工程学院生物技术小桐子Proline转运蛋白代谢网络的构建吴家艳女二年级生物资源与食品工程学院生物技术鉴定小桐子Proline转运蛋白基因家族殷艳花女
5、二年级生物资源与食品工程学院生物技术下载小桐子Proline转运蛋白mRNA序列崔庆哈男二年级生物资源与食品工程学院生物技术根据Proline转运蛋白mRNA序列进行引物设计朱志峰男二年级生物资源与食品工程学院生物技术小桐子Proline转运蛋白基因家族的克隆二、拟申报项目情况(可加页)(一)项目介绍1、研究目标小桐子为大戟科麻疯树属植物，具有很强的抗逆能力。比如：小桐子具有较强的耐干旱瘠薄能力口-文经研究发现，小桐子的抗逆性与其体内脯氨酸(Proline,Pro)浓度高低有关。Pro在体内的浓度越高，抗逆性越强；反之，越低，抗逆性越弱。而Pro在细胞内的代谢与合成由转运蛋白进行转运且Pro转
6、运蛋白在细胞内并不是单个存在。因此本研究基于以上背景，拟开展如下研究：(1)基于KEGG数据库的植物脯氨酸代谢网络分析；(2)基于代谢网络的小桐子脯氨酸转运蛋白基因家族的鉴定；(3)小桐子脯氨酸转运蛋白基因家族的克隆。2、研究背景小桐子是一种多用途植物，一般国内外都将其作为药用植物栽培，以树皮、叶及果实(包括榨油后的渣饼入药。同时.，由于小桐子种子油具有含量高，十六烷值高于欧美要求的标准，燃烧性能接近普通柴油等特点，可作为柴油机和工业锅炉的液体燃料直接使用，因而引起全世界广泛关注。目前已发现并受到广泛关注的能源植物有：小桐子、橡胶树(Heyeabrasiliensis),黄连木(PiStelC
7、iaChinenSis)、木薯(Manihotesculenta)和油桐(VemiCiafi)疝)等。小桐子种子含油率高达40%,超过油菜和大豆等常见的油料作物，且流动性好，与柴油、汽油和酒精的掺合性很好，是优质的可再生能源植物，可直接生产生物柴油。被世界粮农组织列为可再生能源树种，且是最有可能成为未来替代化石能源的具有巨大开发潜力的树种。小桐子UatrophacurcasL.)属大戟科(EUPhorbiaCeae)麻疯树属(JofmpZza)能源植物。原产中南美洲，现广泛分布于全球的热带地区，在中国主要集中在四川、云南、广西、海南、福建等省区其种子含油量高达40%-60%,流动性好，品质优良
8、，部分油脂关键参数优于国内零号柴油，达到了欧四标准，成分接近石化柴油，是理想的柴油替代品。同时，小桐子还是干热河谷地区保水固土、防止沙化、增加有机质、构建防护林的优良树种,榨油的油饼富含蛋白质，经过脱毒后可作为高营养的动物饲料，极具开发与利用价值(6O低温胁迫常常引发渗透胁迫(OSmotiCstress),进而造成次级水分胁迫。低温胁迫下，植物细胞中水活度和流动性下降，加之冷敏植物在低温胁迫下气孔关闭缓慢，导致水分的大量散失；另外，低温也导致代谢速率下降，ATP产量不足，引起冷敏植物根系吸水困难，进一步加剧了冷敏植物的冷害程度，出现萎葛的冷害症状。为了适应渗透胁迫，植物一般采用主动的渗透调节(
9、OSmotiCadjUStment,C)A)来适应逆境。所谓渗透调节是指在渗透胁迫下，植物生长受到抑制，其组织通过降低细胞的渗透势适应水分胁迫的现象。渗透调节的过程是通过积累一定量溶质从而降低植物体内水势而实现的。为了维持植物的正常代谢过程，这些溶质必须是无毒的，它们在植物体内既作为渗透调节剂维持低水势，又保护生物大分子不受盐离子的毒害，在高浓度下不影响功能蛋白的结构和活性，这类溶质称作相容渗透剂(Compatibleosmolyte)。相容渗透剂可分为两类：一类是由外界进入植物细胞的无机离子，包括K+、Ca2+C1Mg?+、No等；另一类是在细胞内合成的有机溶质，包括含氮化合物如脯氨酸(Pr
10、OIine,Pro)、甜菜碱(Betaine,BT),其它氨基酸和多胺(POlyamine)等和含羟基化合物如可溶性糖(SOklbIeSUgar)与多元醇等。其中，分布最广的是脯氨酸、甜菜碱及可溶性糖，所以，渗透调节物质的积累与植物的低温适应性密切相关。脯氨酸是一种小分子的渗透物质，是水溶性最大的氨基酸，许多植物在受到逆境胁迫时都能积累高水平的脯氨酸。植物的脯氨酸合成、累积及代谢是一个受非生物胁迫和细胞内脯氨酸浓度调控的生理生化过程，因此，脯氨酸积累可能是植物受到胁迫的一种信号。遭受胁迫的植物细胞内表现为大量积累脯氨酸件乳目前，已经在多种植物中发现能够转运脯氨酸的蛋白。在植物体内脯氨酸转运蛋白
11、家族(PrOlinetransporter,ProTs)氨基酸通透酶家族(AminoadPeITneaSe,AAPs)和赖氨酸组氨酸转运蛋白家族(LySinehistidinetransporters,LHTs)都能参与脯氨酸在各个器官的运输。ProTs是最早发现能运输脯氨酸的蛋白家族，此外还可以转运GABA和廿氨酸甜菜碱,0oLHS和AAPS家族的成员能转运多数氨基酸，对脯氨酸无特异性，AAPS家族成员主要转运中性氨基酸，LHTs家族成员主要介导碱性和中性氨基酸的转运与吸收l,-141o在拟南芥中对脯氨酸转运相关基因的研究较深入，拟南芥基因组中含有3个ProT家族成员，8个AAP家族成员，1
12、1个LHT家族成员，在根、茎、花和叶等多个部位均有3个家族基因成员表达，但表达量存在明显的组织特异性。作为植物中普遍存在的一种逆境适应机制,脯氨酸积累一直被认为是其合成和降解调控的结果。然而越来越多的研究表明,脯氨酸转运也可能在其积累过程中起重要作用。在植物中,有多个氨基酸转运蛋白家族,如氨基酸通透酶家族(AAPs)、赖氨酸组氨酸转运蛋白家族(LHTS)和脯氨酸转运蛋白家族(PrOTS)参与脯氨酸在各个器官间的运输。此项目对脯氨酸转运蛋白基因家族进行鉴定与克隆。脯氨酸与植物抗逆性的关系：脯氨酸作为蛋白质中的一员，在植物出生代谢中的作用尤为重要。许多研究表明，脯氨酸主要分布在细胞质中，对调节胞质
13、和液泡之间渗透式的平衡起重要作用U61。近期研究表明，脯氨酸在维持蛋白质的高级结构、参与蛋白质的折叠等生理生化过程发挥不可替代的作用(。脯氨酸不仅能减少水分的散失，还可以与变性的蛋白质结合，提高变性蛋白质的亲水性，使变性蛋白处于溶解状态，防止其凝集而干扰细胞代谢。研究表明，脯氨酸也是一种非常有效的抗氧化剂，可清除活性氧。在抗氧化酶系统(SOD、CAT)和过氧化非酶系统(抗坏血酸、维生素E、还原性谷胱廿肽GSH)的协同作用下精密调控活性氧的平衡”叫3.方案设想及现状基于KEGG数据库的植物脯氨酸代谢网络的构建Pro的合成：植物中合成Pro的场所是叶绿体和细胞质,现已知植物中脯氨酸的合成有谷氨酸和
14、鸟氨酸两条途径。初始底物分别为谷氨酸(Gkl)和鸟氨酸(0m)。l-毗咯咻-5-竣酸合成酶(Al-pyrroline-5-carboxylatesynthetase,P5CS)和谷氨酸脱氢酶(Glutamatedehydrogenase,GDH)是谷氨酸合成途径的关键限速和调节酶，而调节鸟氨酸途径的寂心关键酶是鸟氨酸转氨酶(OmithineBaminotransferase,OAT)和精氨酸酶(Arginase)。脯氨酸降解由两个连续的线粒体酶催化即脯氨酸脱氢酶(Prolinedehydrogenase,ProDH)和AI-毗咯咻-5-竣酸脱氢酶(Al-pyrroline-5-carboxyl
15、atedehydrogenase,P5CDH),研究表明，ProDH是脯氨酸降解的限速酶。两种途径对细胞脯氨酸浓度的影响主要取决于植物的种类、生理状态和植物体内的氮素水平等。一般在渗透胁迫条件和低氮条件下谷氨酸途径占主导地位，而在非胁迫条件及高氮条件下鸟氨酸途径占主导地位。Pro的分解:PrO的氧化降解部位是线粒体。Pro的分解代谢始于它的氧化分解，执行此功能的酶称为Pro脱氢酶（PDH）,主要定位于线粒体中,它以FAD为辅因子将Pro降解为P5C,后者在P5C还原酶（P5CR）的作用下又重新合成谷氨酸,完成Pro代谢的循环过程。9-2支所以,在PrO的降解过程中,PDH是PrO降解的关键酶。
16、在逆境胁迫过程中,PDH的活性往往受到不同程度的限制,从而削弱了Pro的降解过程,这也是逆境胁迫下Pro得以迅速积累的主要原因之一。基于代谢网络的小桐子脯氨酸转运蛋白基因家族鉴定及分析根据鉴定的模式植物拟南芥的脯氨酸转运蛋白基因家族登录号，从拟南芥TAIR数据库O下载拟南芥3个ProT基因，8个AAP基因，11个LHT基因，通过ClustalX进行多重序列比对，利用Hmmer3.0软件的Hmmbuild程序将比对文件生成小桐子转运蛋白结构域的隐马可夫HMM模型，同时，从GenBank下载小桐子最新脯氨酸转运蛋白数据库。基于以上模型，利用Hmmer3.0软件的HmmSearCh程序对小桐子蛋白质
17、数据库进行检索（参数设置：阈值E50%）,得到候选的小桐子脯氨酸转运蛋白质序列，利用EXCel脚本去除重复序列，得到最终的小桐子脯氨酸转运蛋白基因家族的蛋白质序列。根据鉴定的小桐子脯氨酸转运蛋白基因家族登录号，从GenBank下载其对应的基因序列、mRNA序列以及CDS（Codingsequence,CDS）序列。利用ProtParam工具O对小桐子脯氨酸转运蛋白进行氨基酸数目、理论分子量（Mw）、等电点（Pl）等基本参数的分析。利用PROSITEO在线分析工具对小桐子脯氨酸转运蛋白序列进行motif分析。利用ClustalX（Version2.0）进行序列相似性比对，然后用MEGA6.0软件
18、通过邻接法（NJ）构建系统进化树，并采用自展法（Bootstrap）进行检验。利用GenDOC软件对CkIStalX比对结果进行小桐子脯氨酸转运蛋白的保守结构域分析。通过CDS序列与基因序列比对以确定基因内含子与外显子的结构，并利用GSDS（GeneStructureDisplayServer,）绘制基因结构图。脯氨酸转运蛋白基因家族克隆下载以上鉴定小桐子脯氨酸转运蛋白的mRNA序列，设计克隆引物，并送深圳华大基因公司合成引物。利用TriZol法提取小桐子叶片的总RNA,并利用DNase1（TaKaRa公司）消化RNA中的残余基因组DNA,得到纯化的总RNAo分别取1.5g总RNA,以Rand
19、omprimer为逆转录引物，利用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司）合成第一链cDNA。以cDNA为模板，使用高保真DNA聚合酶KODFXNeoDNAPolymerase（TOYOBO公司）及引物进行PCR扩增，扩增条件为：98C预变性5min；98变性IOs,60退火30s,68延伸2min,30个循环，68后延伸5min。电泳检测正确的PCR扩增产物。利用GelExtractionKit（OMEGA公司）回收目的基因条带。将回收基因片段与克隆载体PMDI8-T连接，构建重组载体，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，涂LB抗性平板（包含5
20、0mgLAmp）,过夜生长，进行蓝白斑筛选。利用引物进行菌落PCR验证的阳性克隆，送深圳华大基因公司进行双向测序。4、技术路线5、计划进度安排2021.06-2022.06：脯氨酸转运蛋白基因家族代谢网络的构建，小桐子脯氨酸转运蛋白基因家族鉴定。2022.06-2023.06：利用生物信息学技术手段进行引物设计，脯氨酸转运蛋白基因家族克隆。(二)预期成果1、成功构建出小桐子脯氨酸转运蛋白基因家族代谢网络。2、成功鉴定小桐子转运蛋白基因家族并对其进行了生物信息学分析。3、成功克隆出小桐子脯氨酸转运蛋白基因家族。4、撰写进展报告与结题报告。5、发表中文核心期刊科研论文1篇。(=)项目自我评价1、创
21、新点在脯氨酸代谢起主导作用的情况下,脯氨酸转运也可能会影响其在各器官的分布。在拟南芥、水稻和大麦等物种中已经发现了能够运输脯氨酸的氨基酸转运蛋白，其中拟南芥的脯氨酸转运蛋白基因家族已被鉴定，对于小桐子脯氨酸转运蛋白基因家族研究还未见报导。根据本项目的预期结果，将有以下两点创新：(1)构建出了脯氨酸转运蛋白基因家族代谢网络图。(2)鉴定出了小桐子脯氨酸转运蛋白基因家族并对其进行了克隆。2、已有基础(1)申请人所在“云南高原生物资源保护与利用研究中心及云南省高校云贵高原动植物多样性及生态适应性进化重点实验室”属省级高校重点实验室，已有的实验设备包括：荧光定量PCR仪、紫外可见分光光度计、核酸蛋白测
22、定仪、核酸和蛋白质凝胶分析系统，低温光照培养箱、光照培养箱、制冰机、超纯水装置、电子分析天平、全自动高压灭菌罐、超净工作台等，完全能满足本研究所需的实验条件。(2)申请人参与过与实验相关的专业知识及实验操作，掌握基因克隆、载体构建等的实验方法和理论知识，能熟练操作实验。(3)通过查阅资料和已有知识，已初步构建脯氨酸代谢网络及转运途径图Glu:G谷氨酸;GSA：谷氨酸半醛；P5C：I-谷咯酸-5-竣酸;Pro：脯氨酸;0m：鸟氨酸；Arg：精氨酸；P5CS：I-口比咯咻-5-竣酸合成酶；P5CR：IJ比咯咻-5-较酸还原酶；PDH(PrODH):脯氨酸脱氢酶;P5CHD：1比咯咻S竣酸脱氢酶;0
23、AT：鸟氨酸氨基转氨酶；NADH:还原型辅酶I；NADPH:还原型辅酶II;FAD+:黄素腺喋吟二核昔酸图1植物脯氨酸代谢网络及转运途径3、可能存在的问题(1)对生物信息学软件不熟悉，操作起来有困难。(2)在对小桐子转运蛋白基因家族的克隆过程中，引物设计阶段可能会出现瓶颈。(四)参考文献1 OpenshawKA.ReviewofJatrophacurcasanoilplantofunfulfilledpromiseJ.BiomassBioenergy,2000,19(1):1-15.2 HellerJ.PhysicnutJatrophacurcasLJ.InternationalPlantGe
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33、桐子抗冷性的分子机制与功能基因研究。主持国家自然科学基金项目1项，省部级重点项目1项。先后在GigaSCience、ScientificReportsMolecularBiologyReports植物生理学报等期刊发表科研论文60余篇，其中，被SCl收录8篇，EI收录1篇，授权发明专利1项，联合培养硕士研究生1名。主要承担本科生生物化学、植物生理学、生物信息学等的教学工作，并指导学生获得国家级大学生创新创业训练计划建设项目1项，挑战杯，大学生课外学术科技创新作品竞赛项目1项。对申请人的专业基础、工作态度、学风及研究能力的评价：该申请人专业基础优秀，学习积极，上进心和责任心强。具有高度的团队协作
34、意识，视集体的事为己任。对研究和探求怀着澎湃的激情。办事果断，效率高。具备阅读中英文文献的能力，同时已参与教师课题的科学研究，完全具备开展本项目的能力。对申请课题的价值、研究方案的可行性、工作基础等方面的评价:该课题选题方向较为新颖，综合运用分子生物学与生物信息学技术开展研究，实验方案设计科学可行。项目负责人熟悉该领域的国内外研究前沿，同时，具备相应的硬件平台条件，熟悉各种仪器的使用，前期有一定的工作积累和实践经验，完全可以开展以上课题的研究工作。指导老师(签名)：四、申请资助金额和经费预算项目经费资金总额及来源（单位：元）学校经费学院配套经费共计2000020000预算支出科目支出金额预算根
35、据及理由1、实验材料费10000实验材料与器材试剂的购买2、论文版面费4000所撰写论文的版面费3、专利申请费4、图书、资料费1500文献资料的检索及下载5、办公费6、调研费1000外出调研所需的调研交通费和调研食宿费7、会议费2000会议期间所需的住宿费、伙食费、会议场地租金、交通费、文件印刷费等8、其他1500实验室日常管理所需费用及实验仪器维护费用总计20000五、审核意见申请人所在学院审核意见：（请对本申报书中各项内容的真实性、经费预算的合理性及本学院所能提供的支持条件等签署具体意见）负责人签名：学院公章：年月日专家评审意见：（请就是否同意立项及理由签署具体意见）评审负责人签名：年月日学校评审意见：同意立项，学校拟资助经费一OII不同意立项。公章：年月日
