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1、组织学与胚胎学http:/,组织学 Histology胚胎学 Embryology,组织胚胎学的两端：组织学之细胞学，cytology，现在发展成细胞生物学。胚胎学，现在发展成发育生物学。都是前沿学科。,课程安排,细胞 cell-细胞学 cytology组织 tissue-基本组织学 器官 organ-器官组织学胚胎学,组织学histology,主要方法固定组织研究活组织研究观察手段光学显微镜电子显微镜,光学显微镜石蜡切片法,石蜡切片：paraffin section固定fix切片section染色dye固定：将组织用化学试剂浸泡，使组织内蛋白质等成分凝固或沉淀。染色：组织中某些成分与染料化学
2、结合或物理吸附而显色。,固定到切片（常用）,固定脱水-梯度乙醇透明-二甲苯透蜡-石蜡包埋（蜡块）切片（5m）,切片到观察（常用）,脱蜡-二甲苯入水-梯度乙醇苏木精染色梯度乙醇到95%伊红染色脱水透明封片观察,HE染色,用苏木精与伊红染色，是最常用的组织学，病理学染色方法。H：苏木精,Hematoxylin碱性，蓝色 E：伊红eosin酸性，红色嗜碱性:染成蓝色,如:细胞核（核酸，酸性）嗜酸性:染成红色,如细胞质（碱性蛋白），,HE染色的肾小管红色为嗜酸性的胞浆，蓝色为嗜碱性的核,冰冻切片,1冰冻（常用液氮）2切片优点：保存酶活性，抗原保存好，免疫组化应用较多。缺点：形态不如石蜡切片。要求有冰冻
3、切片机。,其他光镜可用制片方法：,简单，实用，不需要特殊设备，有时候必须用涂片（血液，体液）触片撕片装片、磨片。,光学显微镜的结构,机械系统光学系统目镜（10 x,5x,16x）物镜（4x,10 x,20 x,40 x,60 x,100 x)聚光器光源,物镜,最重要，最贵的部位。物镜上数字，以40倍为例：40/0.65，放大倍数，镜口率（数值孔径，N.A)160/0.17机械管长，允许盖玻片厚度。,分辨率的问题,分辨率（Resolving power）又称分辨本领，是用来表示人眼或仪器能够区分开的被观察物体上两点间的最小距离。所能分辨的两点间距离越小，见到的细节就越多，分辨率就越高。人眼在25
4、cm明视距离分辨率为0.2mm，光镜分辨率为0.2m，电镜的分辨率比光镜的分辨率大约提高1000X。,D=0.61/(N*sin(/2),：为入射孔径角，即光线从样品进入透镜的张角：450nm,N：折光率，空气 N=1,香柏油（N=1.5),光镜最大分辨率，D最小值0.2m,光学显微镜种类,普通光镜（明视野）。暗视野（dark field）显微镜。相差显微镜。荧光显微镜。激光共焦扫描显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy）微分干涉显微镜（differential-interference microscope）,明视野效果，无标本处最亮,暗视野效果，无标本
5、处最暗，（花粉管）,相差效果，可以观察透明（不染色）标本。用于观察活细胞,荧光效果，用各种不同的荧光染料,万能显微镜，其实是将几种功能通过配件集中在一台显微镜上,倒置显微镜，其实是将标本置于物镜上方，细胞培养常用,显微摄影，现在更多利用了数码相机,电子显微镜,透射电镜TEM(transmission electron microscope)电子束代替光线，波长短，电磁透镜代替光学透镜。超薄切片，重金属染色（铅，铀盐），吸收电子。,光学显微镜下结构,电子显微镜下结构,透射电子显微镜。分辨率1.44埃，放大倍率80万倍,超薄切片制作过程,电镜与光镜的比较,电镜与光镜光路图比较,扫描电镜(scann
6、ing electron microscope),扫描电镜下的结构,切片上还可以做：,组织化学免疫组织化学原位杂交放射自显影,组织化学（切片上的化学反应）,PAS反应显示多糖perioldic acid shiff reaction切片上多糖HIO4（氧化）多醛；多醛无色品红（shiff试剂）紫红色沉淀（显示多糖存在）,PAS反应,紫红色沉淀（显示多糖存在）,其他一些特殊染色：胭脂红染色,粘液染色,类淀粉染色,含铁血黄素,银染，黑色为银颗粒位置,免疫组织化学：immunohistochemistry,利用抗原抗体特异性结合而显示抗原存在。利用标记技术，如将荧光素（酶）与抗体结合（钥匙），如果切
7、片上某个部位有抗原（锁），当抗原抗体结合后，洗去多余抗体，荧光显示部位即是抗原（某种蛋白）部位。,细胞浆弥漫性阳性反应（细胞角蛋白,CK）DAB显色，甲基蓝复染。,原位杂交in situ hybridization,利用核酸碱基互补的特性。原理跟免疫组化类似。实验要求更高。,CGAT,碱基互补原理,Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养,细胞培养,计量单位,组织学常用的计量单位：10-3，m 毫10-6，微10-9，n纳(埃,10-10 m10-12，p皮如m(微米），11000mm。光镜常用，如细胞大小nm（纳米），1/1000 m。电镜常用，如细胞膜厚度,放大倍数问题,粗略的估算：物镜放大*目镜放大。如40*10问题如洗出照片时，如上是否放大倍数就是400。,参照物的使用。,切面方向与立体结构,横切、纵切。考虑鸡蛋的几个切面,考虑其他可能的切面。掌握切面对于我们了解器官立体结构的重要性。以管状结构为例，同一器官可能有哪些不同切面。12,
