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1、一、下游加工过程在生物技术中的地位,下游加工过程是生物工程的一个组成部分。生物化工产品系通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，从上述发酵液、反应液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程。,生物工程的最新进展大多集中在基因工程方面，在生物反应器和发酵技术方面也有不少进展，而对下游加工过程，则没有给予应有的重视。下游加工过程的落后会阻碍生物技术的发展，特别是有其他生产方法与其相竞争时。在发酵产品的生产中，分离和精制过程占成本的很大部分。例如：传统发酵，分离和精制占整个投资费用的60，而对重DNA发酵、精制蛋白质的费用可占整个生产费用的8090。而且还有继续加剧的趋向。,二、传
2、统生化产品和基因工程产品回收方法的比较,1、传统生化产品都为小分子(酶除外），理化性能已知，放大比较有根据，基因工程产品都是大分子，数据缺乏，放大多凭经验。2、基因工程产品多处于胞内，提取前需细胞破碎。而且发酵液产物浓度也较稀，杂质又多，加上大分子较不稳定，故提取较困难，常需利用高分辨力的精制方法，如色层分离等。其他方面，两者相似。,三、生物技术下游加工过程的特点,培养液是复杂的多相系统，含有细胞、代谢产物和末用完的培养基等。分散在其中的固体和胶状物质，具可压缩性，其密度又和液体相近，加上粘度很大，属非牛顿性液体，使从培养液中分离固体很困难。,1、发酵液成分复杂,2、培养液产物浓度低，但杂质含
3、量却很高。特别是利用基因工程方法产生的蛋白质常常伴有大量性质相近的杂质。,例如在恒温、恒压下，将理想溶液分离为纯物质的最小能量为：,从低浓度混合物中分离纯组分，需较大的能量。,可见所需能量粗略地和浓度的负对数成比例。,据统计，产品的售价大致和浓度的负对数成比例，这与从热力学理论推结果一致。,由于起始浓度低，杂质多，成品要求纯度高，因此常需多步操作。目前，基因工程产品收率达到3040就已是较好。减少提取步骤是相当重要的。,一些产物遇热、极端PH、有机溶剂会引起失活或分解，特别是蛋白质的生物活性与一些辅因子、金属离子的存在和分子的空间构型有关，一般认为剪切力会影响空间构型和使分子降解，对蛋白质的活
4、性影响很大，而最近的研究则表明和膜结合的蛋白质对剪切力较敏感，而溶解的蛋白质则受影响较小。,3、欲提取的生物物质通常很不稳定。,发酵或培养都是分批操作、生物变异性大，各批发酵液不尽相同，这就要求下游加工有一定的弹性，特别是对染菌的批号，也要能处理。发酵液的放罐时间、发酵过程中消沫剂的加入都对提取有影响。,4、弹性要求大,下游加工程应遵循得四条原则：,（1）、时间短（2）、温度低（3）、PH适中（4）、勤清洗消毒,对基因工程产品，还应注意生物安全问题，即要停止菌体扩散，特别对前面几步操作，一般要求在密封的环境下操作。,四、生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作,（一）、一般工艺流程,下游加工过
5、程可分为4个阶段：1)、发酵液的预处理和固液分离 2)、初步纯化(提取)3)、高度纯化(精制)4)、成品加工。,（二）、发酵液的预处理和固液分离,预处理目的：改变发酵液的性质，以利于固液分离。常用方法：1、在活性物质稳定性的范围内，通过酸化、加热、以降低发酵液的粘度。2、加入絮凝剂，使细胞或溶解的大分子聚结成较大的颗粒。,传统的板框压滤机和鼓式真空过滤机在某些场合仍在使用，如对较粗大的真菌菌丝，但在很多场合会遇到困难。一解决方法：在鼓式真空过滤机转鼓的表面预铺一层210 cm厚的助滤剂层，过滤时形成的滤饼不断地用缓慢前进的刮刀，连同极薄的一层助滤剂(百分之几毫米)一起刮去。滤饼用作饲料时，此法
6、不能采用。,此外，离心分离也是常用的方法，较新的装置是倾析式离心机，适用于含固量较多的发酵液。,（三）、细胞破碎和其碎片的分离,细胞破碎方法有机械、生物和化学等方法。大规模生产常用高压匀浆器和球磨机。前者主要利用液相剪切力和与固定表面撞击所产生的应力；后者主要依靠研磨，两者机理不同，可相互补充。细胞碎片的分离通常用离心分离的方法，但非常困难。一种新的办法是利用两水相萃取法，选择适当的条件使细胞碎片集中分配在下相。,（四）、初步纯化(提取),目的：主要是浓缩，也有一些纯化作用。方法：吸附法、离子交换法、沉淀法 溶剂萃取法、两水相萃取法、超临界流体萃取、逆胶束萃取、超过滤,A、吸附法,应用范围：主
7、要用于抗生素等小分子物质。原理：利用吸附剂与抗生素之间的分子引力而将抗生素吸附在吸附剂上。吸附剂种类：活性炭、白土、氧化铝、各种离子交换树脂。活性炭应用最广。活性炭的缺点：吸附性能不稳定，选择性不高，可逆性差，不能连续操作，劳动强度大，影响环境卫生。,B、离子交换法,主要用于小分子的提取，系利用离子交换树脂和生物物质之间的化学亲和力，有选择性地将生物物质吸上去，然后以较少量的洗脱剂将它洗下来。生物物质必须是极性化合物，即能形成离子。吸附和洗脱具有选择作用，能达到浓缩和精制的目的。一般的离子交换树脂的骨架具有憎水性，与蛋白质的憎水部份有吸附作用，而使蛋白质变性失活。以天然糖类为骨架的离子交换剂，
8、由于其骨架具有亲水性，可用求提取蛋白质，例如以纤维素为骨架的离子交换剂。,C、沉淀法,盐析：最常用的盐类是硫酸铵。加入有机溶剂：调pH至等电点：此法沉淀能力不强，常同时加入有机溶剂，使沉淀完全。加入非离子型聚合物：如PEG，机理和有机溶剂相似。加入聚电解质：如聚丙烯酸，机理和盐析作用相似。,广泛用于蛋白质提取。主要起浓缩作用。,通常是加入一些无机、有机离子或分子，能和生物物质形成不溶解的盐或复合物，而沉淀在适宜的条件下，又很易分解。例如：四环类抗生素在碱性下能和钙、镁、钡等重金属离子或溴化十五烷吡啶形成沉淀，发酵单位越高，沉淀法越有利，因残留在溶液中的浓度是一定的，故发酵单位越高、收率就越高。
9、,沉淀法也用于小分子物质的提取中，但具有不同的机理。,D、溶剂萃取法,应用范围：一般用于抗生素等小分子生物物质的提取。基本原理：抗生素以不同的化学状态(游离态或成盐)存在时，在水及与水不互溶的溶剂中有不同的溶解度。当进行转移时，杂质不能或较少地随着转移，因而能达到浓缩和提纯的目的。有时，一次转移并不能将杂质充分除去，可采用二次萃取。举例：青霉素在酸性下成游离酸状态，在醋酸丁酯中溶解度大，能从水转移到醋酸丁酯中：在中性下，成盐状态，在水中溶解度大，能从醋酸丁酯转移到水中。,溶剂萃取法常遇到困难是分配系数较低，一种解决的方法是利用反应萃取法，即利用一种溶剂(通常是有机磷化合物或脂肪胺)，能按一定化
10、学计量关系与生物物质形成特异性的溶剂化健或离子对复合物。,E 两水相萃取法,适用范围：仅适用于蛋白质的提取，小分子物质不适用。基本原理：由于聚合物分子的不相容性，两种聚合物的水溶液（含盐或不合盐)可以分成两相，蛋白质分子可在两相间进行分配。举例：聚乙二醇PEG与葡聚糖的水溶液。一种聚合物（如PEG）和一种盐（如磷酸盐）也能形成两相。影响分配系数的因素：聚合物的种类和浓度、聚合物的分子量，离子的种类，离子强度，PH和温度等，而且这些因素相互有影响。,F 超临界流体萃取,临界点：一般物质，在常压下平衡时，汽液两相的物理性质（如粘度、密度等）相差很显著。在较高压力下，这种差别逐渐缩小，当达到其一温度
11、与压力时，两相差别消失，合并成一相，这时称为临界点，其温度和压力分别称为临界温度和临界压力。超临界流体：当温度和压力略超过或靠近临界点时，其性质介于液体和气体之间，称为超临界流体。,超临界流体萃取原理：超临界流体的密度和液体相近，粘度和气体接近，溶质在其中的扩散速度可为液体的100倍，这是超临界流体的萃取能力和速度，优于一般溶剂的原因。而且流体的密度越大，萃取能力也越大，变化温度和压力可改变萃取能力，使对某物质具有选择性。二氧化碳：常用作为萃取剂，因其临界压力较低，（31.1C，7.3 Mpa）操作安全，无毒，适用于非极性物质，对极性物质萃取能力差，但可加入极性的辅助溶剂（夹带剂entrain
12、er)来补救。本法还具有节约能量等优点，已开始应用在食品工业和生物工程中。已用于咖啡脱咖啡因，啤酒花脱气味等。,逆胶束萃取目前还处于实验室研究阶段，但有希望用于大规模蛋白质提取中。原理：逆胶束可以看作是50一100 nm的水溶液微滴依靠表面活性剂分散在非极性溶剂中。在逆胶束中，蛋白质处于水溶液的环境中，因而不会失活，如水溶液中含有几种蛋白质时，则可调节系统的条件，使一些蛋白质溶于逆胶束中，而其他蛋白质则不能。,G 逆胶束萃取reversed micelle extraction,原理：超滤法是利用一定截断分子量的超滤膜进行溶质的分离或浓缩。小于截断值的分子能通过膜，而大于截断值的分子不能通过膜
13、，因而达到分离。应用范围：适用于超滤的物质，分子量在500一1000000之间，或分子大小近似地在(1一l0 nm)之间。在小分子物质的提取中，超滤主要用于去除大分子杂质。在大分子物质的提取中，超滤主要用于脱盐、浓缩。主要缺点：浓差极化和膜的污染，膜的寿命较短和通量低，很难用于处理量大的工业中。但这些缺点正在克服，有很好的发展前景。,H、超滤法,（五）、高度纯化(精制),经初步纯化后，体积大大缩小，但纯度提高不多，需要进一步精制。精制的方法很多，初步纯化中的某些操作，如沉淀、超滤等也可应用于精制中。大分子(蛋白质)和小分子物质的精制方法有类似之处，但侧重点有所不同，大分子物质的精制依赖于色层分
14、离，而小分子物质的精制常常利用结晶操作。,色层分离是一种高效的分离技术，过去仅用于实验室中，最近10年来规模逐渐扩大而应用于工业上。原理：操作是在柱中进行，包含两个相固定相和移动相，物质在两相间分配情况不同，在柱中的运动速度也不同而获得分离。,A 色层分离,色层分离的类型,结晶的先决条件是溶液达到过饱和。方法：加入某些物质，使溶解平衡发生改变，例如调pH；将溶液冷却或将溶剂蒸发：正确控制温度、溶剂的加入量和加料速度可以控制晶体的生长，以有利于结晶的选择性和利用分离。适用范围：主要用于低分子量物质的纯化。举例：例如抗生素。青霉素G系用醋酸丁酯从发酵液中萃取出来，然后加入醋酸钾的酒精溶液以产生沉淀
15、。柠檬酸在工业上用冷却的方法进行结晶。,B 结晶,（六）、成品加工,根据产品应用时的要求，一般经提取和精制后，最后还需要一些加工步骤。例如浓缩、无菌过滤和去热原、干燥、加入稳定刑等。如果最后要求的是结晶性产品，则浓缩、无菌过滤和去热原等步骤系放在结晶之前，但干燥常常是最后一道工序。,A、浓缩,浓缩可以采用升膜或降膜式的薄膜蒸发(停留时间为l min左右)。对热敏性物质可采用离心薄膜蒸发器(停留时间为1一l0s)，而且可处理粘度较大的物料。最近发展起来的膜技术，也可应用于浓缩，对大分子溶液的浓缩可以用超滤膜，对小分子溶液的浓缩可用反渗透膜。应用膜技术的优点是能耗低，成本较低。,热原：是脂多糖类物
16、质，从细菌的细胞壁产生，注入体内会使体温升高。传统去热原方法：蒸馏或石棉板过滤，但前者只能用于产品能蒸发或冷凝的场合，后者对劳动保护和产品质量都有一定问题。当产品分子量在1000以下，用截断分子量为10000的超滤膜除去热原是很有效的，同时也达到了无菌要求。,B、无菌过滤和去热原,C、干燥,真空干燥：效率不高，需要时间较长。红外线干燥：虽然装置简单，但温度较高。气流干燥和沸腾干燥：效率较高，但物料所处温度也较高。喷雾干燥：虽然温度也较高，但干燥速度快，干燥时间一般只需几秒钟，在干燥器中停留时间小于1分钟。冷冰干燥：温度低，不会使物料失活，最安全，但处理量小，操作时间较长(一般不会低于8h)，且
17、装置复杂、费用昂贵。,五、生物技术下游加工过程的发展趋向,(1)、基础理论研究、研究非理想溶液中溶质与添加物料之间的选择性反应机理以及系统外各物理因子对选择性的影响效应，从而研制高选择性的分离剂，改善对溶质的选择性。,、研究界面区的结构、控制界面现象和探求界面现象对传质机理的影响，从而指导改善具体单元操作及过程速度，如改善萃取或膜分离操作和结晶速度等。作为生化分离工程设计基础的热力学和动力学等基础理论几乎还是空白，常常依靠中试加以解决，所以必须加大力度展开这方面的研究。,、下游加工过程数学模型的建立。在化学工业中，数学模拟技术的使用已有多年的历史，但是在生化分离工程上，还刚刚开始，需要发展和完
18、善，获得合适的过程模拟软件，以对下游加工过程进行分析、设计和技术经济评估等。,(2)、完善、研究、开发新型和经济高效的下游加工技术、正确对待“新”、“老”分离技术，努力推进多种分离、纯化技术的结合。生物技术产品的下游加工过程，既包括了历时已100多年的若干传统的化工单元操作，如精馏、干燥、吸收等，也包括了诸如膜分离、亲和反应等新的单元操作，其中已得到工业应用的单元操作，大体上可用图13来说明。,由图13可以看出各种单元操作目前的“技术成熟度”(横坐标)与“工业应用度“(纵坐标)之间的近似关系。,要积极推广应用新技术：,1、膜技术的推广使用2、亲和技术的推广使用3、优质层析介质的研究,当前下游加
19、工过程发展的一个主要倾向是:,多种分离、纯化技术相结合.也包括新、老技术的相互交叉、渗透与融合形成所谓融合技术(子代技术).,例如：萃取与离子交换相结合，形成了溶剂浸渍树脂和萃淋树脂分离技术；,又如:膜分离与亲和配基相结合，形成了亲和膜分离过程 离心分离与膜分离过程相结合，形成了膜离心分离过程.,这类技术具有选择性好、分离效率高、下游加工过程步骤简化、能耗低、加工过程水平高等优点，是今后的主要发展方向，近年来研究较多、并且有较大实用价值的过程。,、生物技术下游工程与上游工程相结合。生物工程作为一个整体，上、中、下游要互相配合。上游方面要注意为下游提取方便创造条件。,例如：将胞内产物变为胞外产物
20、；在细胞中高水平的表达形成细胞内的包涵体，在细胞破碎后，在低离心力下即能沉降；利用基因工程方法，使尿抑胃素上接上几个精氨酸残基，使其碱性增强，易为阳离子交换剂所吸附等。,发酵与分离耦合过程的研究是研究热点之一。早在20世纪70年代，就开始用于乙醇的发酵过程中，取得了满意效果，近年来逐步用于好氧发酵。优点：可以解除终产物的反馈抑制效应，提高转化率，同时可简化产物提取过程，缩短生产周期，增加产率，收到一举数得的效果。,、强化化学作用对下游加工过程的影响。提高分离过程的选择性和设备效率最有效的一种方法，其中重点研究的内容有以下两大类。A强化化学作用对体系分离能力的影响。一是选择适当的分离剂，增大分离
21、因子，从而提高对某一组分的选择性；二是向分离体系投入附加组分，改变原来体系的化学位，从而增大分离因子。,B强化化学作用对相界面传质速率的影响。利用一些相转移促进剂来增大相间的传质速率，如在渗透蒸发分离乙醇时，若选用含有COOH基的膜就更有利于分离去水，这是因为COOH基能与水生成氢键，从而提高了分离的选择性和传质速率。将相转移促进剂结合在固相界面上的分离过程，即各类“亲和”分离过程如亲和层析、亲和吸附、亲和过滤、亲和膜分离等是强化分离过程的一个前沿研究方向。,、改进上游因素，简化下游加工过程。这可从以下两方面考虑。A生物催化剂。B培养基和发酵条件。,（3）工程问题的研究 生物技术产品的工业化需要将实验室技术进行放大，而某些专一性、高附加值的产品又需要进行过程缩小，这就需要借助化学工程中有关“放大效应”、“返混”、“质量传递”、“流体输送”等基本理论，结合生化过程的特点，研究大型生化分离装置中的流变学特性、热量和质量传递规律，探明在设备中的浓度、酸度、固含量、温度等条件的分布情况，制定合理的操作规范，改善设备结构，掌握放大方法，达到增强分离因子、减小放大效应、提高分离效果的目的。,(4)、生物技术下游加工过程必须向减少对环境污染的清洁生产工艺转变 确保工厂排污更符合环保要求保证原材料、能源的高效利用，并尽可能确保未反应的原材料和水的循环利用。,本章结束，谢谢大家！,
