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1、产前诊断中绒毛、脐血、羊水取样及标本培养,南京大学附属鼓楼医院妇产科产前诊断中心xxx 副主任医生,1,谢谢欣赏,2019-9-17,2019-9-17,谢谢欣赏,产前诊断指征,夫妇任一方有染色体异常；曾生育过染色体病患者；夫妇任一方为单基因病患者；曾生育过单基因病患者；有不明原因的自然流产史、畸胎史、死产或新生儿死亡史；,2,2019-9-17,谢谢欣赏,产前诊断指征,羊水过多的孕妇；夫妇任一方曾接触致畸因素；孕妇年龄大于35岁；有遗传病家族史的近亲婚配的夫妇。产前筛查高风险的孕妇超声胎儿结构筛查胎儿有结构异常的孕妇,3,2019-9-17,谢谢欣赏,产前诊断的方法,羊膜腔穿刺取样（amni
2、ocentesis）绒毛穿刺取样（chorion villus sampling,cvs）脐带血取样（periumbilical cord blood sampling,PUBS）植入前诊断（preimplantaton genetic diagnosis,PGD）,4,2019-9-17,谢谢欣赏,产前诊断的方法,胎儿组织取样（皮肤、肝脏）胎儿镜（fetoscope）胚胎镜（embryoscope）胎儿超声波图象（fetal ultrasound imaging）母体外周血胎儿细胞检测（cell-storing）,5,2019-9-17,谢谢欣赏,绒毛穿刺取样历史,1975年 我国鞍山钢铁公
3、司铁东医院首次问世（经宫颈盲吸法，准确率95%，自然流产率9.3%，出生婴儿未发现异常）莫斯科产科研究所（超声引导下经宫颈吸样）1983您 Ward 和 Brambati 分别于英国和意大利发表文章介绍绒毛取样及核型分析,6,2019-9-17,谢谢欣赏,绒毛穿刺取样时间,妊娠911周,7,2019-9-17,谢谢欣赏,绒毛穿刺取样抽取量,20mg左右（染色体核型分析约需10mg，DNA分析约需5mg，生化测定约需5-10mg）,8,2019-9-17,谢谢欣赏,绒毛穿刺取样并发症,胎儿丢失胎儿肢体发育缺陷（LRD）,9,2019-9-17,谢谢欣赏,CVS并发症胎儿丢失,CVS的流产率不比a
4、mniocentesis高经宫颈和经腹取样安全性相同（Jackson,1992）多胎取样高于单胎取样（Pergament,1992）,10,2019-9-17,谢谢欣赏,CVS并发症LRD,1999年WHO发布CVS综合性资料认为CVS与LRD无关（216，381例CVS中115例出现LRD发生率1：1881，总的人群发生率1：1642）世界各地相关资料综合，9周以下CVS出现LRD的机会高，但原因尚不清楚CVS不应在小于孕10周的条件下进行,11,2019-9-17,谢谢欣赏,绒毛穿刺取样方法,经宫颈（transcervical）经腹（transabdorminal）,12,2019-9-1
5、7,谢谢欣赏,CVS方法经宫颈取样,B超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实时超声诊断仪，经腹探头频率3.5MHz,经阴道探头频率5-7MHz。采用特制较细的滋养层活检导管（多聚乙烯导管），其塑料导管外径1.4 1.6 mm,长20cm,带有导管芯，导管前端稍弯，外形似宫腔探子。导管另一端连接10-20ml含有2-4ml生理盐水的注射器,13,2019-9-17,谢谢欣赏,CVS方法经腹取样,双针活检系统由1根长15cm、外径1.2mm的18号引导套针，及1根长20cm、外径0.8mm的22号活检针组成。在超声引导下，先将引导套针经腹壁及子宫穿刺入胎盘绒毛边缘部分，拔出针芯，然后将活检针经引导套针内送
6、入胎盘绒毛组织,连接含2-4ml生理盐水的20ml注射器，以5ml的负压上下移动活检针吸取绒毛组织,14,2019-9-17,谢谢欣赏,CVS注意事项,动作要轻柔穿刺部位在胎盘绒毛叶抽吸次数不宜过多,15,2019-9-17,谢谢欣赏,羊膜腔穿刺历史,1956年 Fucks进行羊膜腔穿刺行胎儿性别鉴定及胎儿Rh溶血诊断1966年 Mark steele和Roy Breg从羊水中分离出羊水细胞培养成功并行胎儿核型分析,16,2019-9-17,谢谢欣赏,羊膜腔穿刺时间,1620周,17,2019-9-17,谢谢欣赏,羊膜腔穿刺抽取量,2030ml,18,2019-9-17,谢谢欣赏,抽取的羊水用
7、途,核型分析诊断染色体病DNA分析诊断单基因病生化测定诊断NTD、代谢性疾病,19,2019-9-17,谢谢欣赏,羊水穿刺,穿刺前孕妇俯卧位摇动腹部超声波定位引 导采用22号或21号带芯长腰穿刺针头垂直、快速进针抽取羊水2ml弃置，换空针抽取羊水,20,2019-9-17,谢谢欣赏,羊膜腔穿刺并发症,胎儿丢失羊膜腔感染羊水渗漏穿刺部位的出血、血肿,21,2019-9-17,谢谢欣赏,羊穿并发症-胎儿丢失,1976年，Nihd Registry 报道流产率3.5%1986年，Tabor et al 报道流产率1.7%1995年，Bombard et al 报道流产率1.3%2000年,Antsa
8、klis 报道流产率2.1%,22,2019-9-17,谢谢欣赏,脐带血穿刺历史,1972年，Valenti用儿科膀胱镜在中期妊娠孕妇行子宫切开术插入羊膜腔，获取脐血标本。1979年，Rodeck和Campell应用胎儿镜行脐带血管穿刺，但由于并发症高，应用受到限制。1983年，Ternand Daffos超声引导下经皮脐血管穿刺取血（Cordocentesis）,23,2019-9-17,谢谢欣赏,脐带血穿刺时间,16周分娩（最佳2428周）,24,2019-9-17,谢谢欣赏,脐带血穿刺取血量,35ml20周后抽取68ml对胎儿循环无不良影响,25,2019-9-17,谢谢欣赏,脐带血穿刺
9、适应症,胎儿核型分析或基因检测（胎儿畸形、严重的FGR、羊水或绒毛细胞培养失败、羊水或绒毛培养结果为嵌合体、非免疫性胎儿水肿、脆性X综合症等）胎儿血液疾病分析（血型、血小板计数等）胎儿感染（弓形虫、病毒感染等）胎儿情况评估（酸碱平衡、甲功等）遗传性疾病（单基因病、凝血障碍、血红蛋白病、代谢性疾病等）胎儿治疗（宫内输血、宫内药物治疗等）,26,2019-9-17,谢谢欣赏,脐带血穿刺并发症,穿刺部位的出血脐带血肿短暂性胎心减慢宫内感染胎儿丢失（流产、早产）大多数并发症为短暂性和非致命性,27,2019-9-17,谢谢欣赏,脐带血穿刺并发症胎儿丢失,Maxwell 1991年报道胎儿超声结构筛查示
10、正常超声者脐穿的流产率为1%（1/76）；异常超声者流产率为7%（5/76）；胎儿结构明显异常者流产率为25%（9/36）Antsaklis 1998年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率1%（2/191）；异常超声者流产率为13%（11/84）,28,2019-9-17,谢谢欣赏,脐带穿刺部位,29,2019-9-17,谢谢欣赏,脐血穿刺确定胎儿血样,血红蛋白电泳Kleihauer-Betke试验：胎儿红细胞在酸中稳定APT试验：NaOH中胎儿血为粉红色有核红细胞的出现,30,2019-9-17,谢谢欣赏,脐血穿刺排除脐血中母血污染,X染色体DMD基因内部5对CA重复序列的连锁分析,
11、31,绒毛组织、羊水细胞、脐血细胞培养,32,谢谢欣赏,2019-9-17,2019-9-17,谢谢欣赏,绒毛组织的培养,直接法培养法（悬浮培养、贴壁培养）,33,2019-9-17,谢谢欣赏,绒毛组织的染色体检查直接法,孕早期Langhans细胞有较高的有丝分裂活性，能提供足以分析的良好有丝分裂相，较绒毛培养简易可靠、操作简单快速,34,2019-9-17,谢谢欣赏,绒毛组织的染色体检查直接法,绒毛组织的分离洗脱加秋水仙素（终浓度2ug/ml，可一次加，也可分次少量加）37OC 5%CO2培养箱培养45分钟低渗（1%枸橼酸钠低渗10分钟或1%枸橼酸钠和0.075mol/l 1：1低渗40分钟
12、）预固定（甲醇：冰醋酸 3：1）10分钟固定（甲醇：冰醋酸 3：1）10-20分钟冰醋酸解离绒毛细胞（轻吹打）制片,35,2019-9-17,谢谢欣赏,绒毛组织的染色体检查悬浮培养法,绒毛挑选洗脱绒毛组织剪成小块入培养瓶（25ml培养瓶每瓶10mg）加特定培养液3ml培养3-6天收获（加秋素、低渗、固定、制片）,36,2019-9-17,谢谢欣赏,绒毛组织的染色体检查贴壁培养法,绒毛组织挑选洗脱绒毛组织剪成小块加0.25%+0.02%EDTA 5ml 37OC 摇床中20分钟加培养基终止消化，离心后弃上清加培养基接种培养5-10天收获,37,2019-9-17,谢谢欣赏,羊水细胞培养细胞类型,
13、成纤维样细胞（F细胞）上皮样细胞（密集型上皮样细胞-E细胞、镰刀样上皮细胞、圆形上皮细胞）羊水样细胞（AF细胞）,38,2019-9-17,谢谢欣赏,羊水细胞培养收获方法,原位法消化法刮取法,39,2019-9-17,谢谢欣赏,羊水细胞培养中存在的问题 污染,细菌真菌支原体病毒其他细胞,40,2019-9-17,谢谢欣赏,羊水细胞培养中存在的问题 母体细胞污染,若胎儿为男性，由于母体细胞污染误将胎儿诊断为嵌合体母体细胞在培养中占优势,41,2019-9-17,谢谢欣赏,羊水细胞培养中存在的问题 母体细胞污染的预防,羊水穿刺时，把最先抽得的1-2ml羊水弃掉染色体多态现象的测试羊水细胞、母体细胞
14、 的HLA组织定型鉴别,42,2019-9-17,谢谢欣赏,羊水细胞培养中存在的问题 细胞不生长、不贴壁,最常见的原因是支原体污染培养基PH不适当，偏酸（6.4或偏碱7.4均不利最合适的穿刺时间16-20周,43,2019-9-17,谢谢欣赏,羊水细胞培养中存在的问题 细胞及染色体收获少,每天观察细胞生长（梭形细胞背景上有透明透亮的圆形细胞）滚圆的细胞与有丝分裂的圆形细胞鉴别操作应轻柔，胰酶消化法要掌握好胰酶消化的时间羊水中胎脂多时3-5天可轻轻动一动，减少胎脂贴壁占据空间低渗时间短于外周血（一般3-5分钟）,44,2019-9-17,谢谢欣赏,脐带血细胞培养,量少于外周血（一般5ml注射器小于14滴）其他同外周血,45,2019-9-17,谢谢欣赏,Thanks!,46,2019-9-17,谢谢欣赏,47,
