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1、流式细胞术简介,王苗苗,流式细胞术,流式细胞术（Flow Cytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,流式细胞仪的工作原理,待测细胞以单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色，放入样品管，吸入流动室。流动室充满鞘液，作用：约束样品在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。,流式细胞仪的工作原理,液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。荧光信号
2、变成电信号输出到计算机，软件分析。,流式细胞仪可检测到的细胞参数,非荧光信号,颗粒度,细胞大小,前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性,前向角散射光 FSC,侧向角散射光SSC,散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异-通常使用“散点图”来看散射光信号-散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据,荧光强度（FL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）高FL细胞与低FL细胞区分开来（强弱）一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出
3、三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源（488nm、633nm和325nm），可测出6个FL。,荧光信号,荧光检测器,定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量 多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量,荧光信号与细胞特性,光电倍增管（PMT），用来检测从细胞发出的不同颜色的荧光信号双色反光镜，通过反射一定范围的光，透过其余光来实现分离作用滤光片，能透过一定波长的光，但是没有反射功能，放着角度是与光束成90度。,参与信号处理的光学元件,460 500 540,460 500 540,460 500 540,SP 500,LP 500,BP500/50,Lon
4、gpassShortpassBandpass,滤光片,FACSCalibur光路图,488 nm,635 nm,FCM测量数据的显示与分析,几个概念：%Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。脉冲宽度（pulse width）表示细胞的粘连情况脉冲面积（pulse area）主要用于DNA的含量测定FL1、.、FL13等表示细胞在各检测波长的荧光信号,FL2-A 表示在FL2通道上以荧光强度对细胞数作积分，用面积来计算处于不同时相的细胞的总数。,数据显示:直方图、二维点图、等高线图、密度图、三维图等,最常用的为散点图和直方图。,图 报告中常见的几种流式细胞图,散点图,密度图,
5、二维等高图,直方图,图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死,单参数直方图 每一个细胞单参数的测量数据可整理成分布统计，以分布直方图(distribution histogram)来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。,直方图分析,双参数数据的显示 双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参数与细胞数量的关系，常用的表达方法有二维点图(dot plot)、等高线图(contour plot)、二维密度图(density plot)。在二维图中，x坐标为某细胞一个参数的数值，而Y坐标为该细胞另一参数的数值
6、。从双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。,外周全血细胞散射光双参数点图,等高图和密度图分析,三维图分析,细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量染色体分析,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体细胞凋亡,流式细胞仪的细胞学应用,流式细胞仪的临床应用,HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病,细胞DNA,RNA 含量的测定染色体
7、倍体分析染色体分离基因表达产物的生物活性研究基因转染表达的生物效应基因表达调控研究细胞内基因定位酵母转基因株的筛选报告基因的定性定量检测植物遗传学研究,流式细胞仪的遗传学应用,Flow cytometry of apoptotic cell death,细胞散射光 在细胞调亡中，细胞收缩，从而FSC下降，SSC上升或是没有明显变化,Flow cytometry of apoptotic cell death,荧光吸收细胞的胞膜对于DNA染料的通透性和细胞的活性、死亡和凋亡相关，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用来区分活细胞、死细胞和凋亡细胞,Viability was meas
8、ured as impermeabilityto propidium iodide.,Flow cytometry of apoptotic cell death,细胞DNA含量 在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。,DNA细胞周期分析,细胞周期,G2,M,G0,G1,s,200,400,600,800,1000,s,DNA分析,DNA含量,细胞数量,Flow cytometry of apoptotic cell death,线粒体功能的变化 使用有膜穿透性的亲脂性阳离子荧光染料，如Rho123,DiOC6,JC-1等，可作为流式检测的探针。,Flow cytometry of apoptotic cell death,FCM of Caspases通过抗体和活化的caspase-3片断相结合来检测使用特异性的caspase-3荧光底物,Flow cytometry of apoptotic cell death,谢谢大家,
