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1、04 蛋白质工程制药,S1 蛋白质工程制药概述S2 蛋白质工程的基本技术S3 蛋白质工程制药实例,S1 蛋白质工程制药概述,从基因工程药物到蛋白质工程药物蛋白质工程的诞生、概念蛋白质工程的基本过程蛋白质分子设计,基因工程药物蛋白质工程药物,1982年第一个基因工程药物：重组人胰岛素,重组蛋白存在问题：,1、稳定性差：体内半衰期短2、药理活性不够强：使用剂量偏大3、毒副作用大4、生产工艺复杂,蛋白质工程药物,蛋白质工程的诞生,1970S末，Smith等人建立了寡核苷酸点突变改变DNA序列的方法1982年，一些实验室用此技术来改造蛋白质分子，研究蛋白质的功能1983年，Ulmer发表了题为“Pro
2、tein Engineering”的专论目前已应用于医药领域，并有多种产品上市,已上市的蛋白质工程药物,1、体内半衰期短2、药理活性不够强3、毒副作用大4、生产工艺复杂,已上市的蛋白质工程药物,1、体内半衰期短2、药理活性不够强3、毒副作用大4、生产工艺复杂,已上市的蛋白质工程药物,1、体内半衰期短2、药理活性不够强3、毒副作用大4、生产工艺复杂,蛋白质工程的概念,蛋白质工程（Protein Engineering）(第二代基因工程)是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计以及DNA重组技术，把天然的蛋白质改造成合乎人类需要的新的突变蛋白质(mutein)的一项技术。,蛋白质工程
3、的概念,内涵：1、从DNA水平改变基因，改造蛋白质2、一个或多个氨基酸残基 结构域 全新蛋白质3、有目的地改造，获得期望功能 强调分子设计4、结合DNA重组技术,从不同尺度改造,蛋白质工程的基本过程,蛋白质工程的基本过程,1、分离纯化所需改造的目的蛋白2、对蛋白进行氨基酸序列测定、X射线晶体衍射分析、核磁共振分析等结构和功能信息3、根据结构和功能信息、生物信息学信息，运用蛋白质分子预测技术提出蛋白质设计方案4、分离克隆该蛋白编码基因，并进行突变改造5、插入适当的载体表达6、分离纯化表达产物，检测其生物学功能,蛋白质分子设计,三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略,蛋白
4、质分子设计,蛋白质分子设计的三个基本条件：,1、蛋白质分子的基本知识：理化性质、结构与功能、构象规律2、对具体改造的蛋白质分子必须有一个系统、全面和深入的了解3、分子设计的基本工具：高性能的计算机硬件、功能齐全的计算机软件只有在此基础上，才能应用蛋白质分子预测技术，提出合理的设计方案,三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略,蛋白质分子设计,蛋白质分子设计的分类,1、小范围改造：对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换、部分片段的缺失，改善蛋白质的性质和功能。2、较大程度的改造：根据需求对来源于不同蛋白质的结构域进行拼接组装，或在蛋白质分子中进行大范围肽链替换、结构域替
5、换，获得多功能复合体。3、蛋白质从头设计（de novo protein design）,三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略,概念：从蛋白质分子一级结构出发，设计制造自然界中不存在的全新蛋白，使之具有特定的空间结构和预期的生物功能。,1、需要扎实的理论基础2、在分子设计与试验验证之间交互进行,蛋白质从头设计,蛋白质分子设计,三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略,PDA循环（Protein Design Automation）,1、设计模拟实验分析2、不断循环：一步步的修正最终获得成功,蛋白质从头设计,蛋白质分子设计,三个基本条件蛋白质分
6、子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略,蛋白质从头合成的范例 凋亡诱导肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2,KLAKLAK：可形成典型的两亲-螺旋结构，进入细胞后，可破坏线粒体膜引起细胞凋亡,NGR：与新生血管的内皮细胞特异结合，起到靶向弹头的作用,蛋白质从头设计,蛋白质分子设计,三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略,利用NGR为弹头，将KLALAK肽特异地导向肿瘤部位的新血管内皮细胞，通过抑制新血管的生成，从而抑制肿瘤的形成，且对其他细胞没有明显的毒性。,300mol/L 3mol/L,蛋白质从头合成的范例 凋亡诱导肽：CNGRC-GGn-（KLAK
7、LAK）2,蛋白质从头设计,蛋白质分子设计,三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略,蛋白质从头合成的范例 凋亡诱导肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2,蛋白质从头设计,蛋白质分子设计,考虑的其他因素1、Gly-Gly接头：防止两功能部位的立体结构相互影响。2、L-型氨基酸（D-型）：防止蛋白酶的降解,三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略,蛋白质从头合成的范例 凋亡诱导肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2,蛋白质从头设计,蛋白质分子设计,实验结果,1、特异地被激活的新生血管内皮细胞内吞，引起凋亡2、在小鼠肿瘤模型中，可抑制肿瘤
8、的生长，明显延长治疗组小鼠的存活时间3、对健康小鼠超剂量使用时，没有毒副作用的产生,三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略,1、顺式思维理性化设计 合理化设计2、基于各种功能筛选平台的非理性逆向改造策略 非理性的体外进化3、两种策略的结合,蛋白质分子设计的策略,蛋白质分子设计,三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略,1、顺式思维理性化设计 合理化设计基于现有知识信息：蛋白质的结构与功能；因此，受到已有认识水平的制约。,蛋白质从头设计,蛋白质分子设计的策略,蛋白质分子设计,三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略,2、基
9、于各种功能筛选平台的非理性逆向改造策略非理性的体外进化,1）构建包含众多突变蛋白的文库：随机突变、DNA改组等2）筛选文库：从功能入手进行筛选所需要的蛋白3）进行蛋白质基本结构、序列信息的分析,蛋白质分子设计的策略,蛋白质分子设计,三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白质从头设计蛋白质分子设计策略,3、两种策略的结合,非理性的体外进化：弥补合理性化设计应用中的局限性，并且迅速得到大量有功能的目标分子，通过分析积累所需的蛋白质结构与功能相关信息合理化设计：对非理性筛选出的候选分子进行合理化的分子修正，使之进一步符合实际需求,蛋白质分子设计的策略,蛋白质分子设计,三个基本条件蛋白质分子设计的分类蛋白
10、质从头设计蛋白质分子设计策略,S2 蛋白质工程的基本技术,定点突变技术,随机突变技术,1、寡核苷酸引物介导 的定点突变2、PCR介导的定点突变3、盒式突变,4、易错PCR5、DNA改组技术,易错PCR,连续易错PCR（sequential error-prone PCR）：经以上一次PCR突变的基因很难获得满意的结果，于是将前一轮PCR扩增得到的有用突变基因作为下一轮PCR的模板，每次获得的突变累积起来，产生重要的有益突变。,可遗传的变化只发生在单一分子内部，属于无性进化（asexual evolution）,易错PCR（error-prone PCR）：利用缺乏修复功能的Taq酶，并设置容易
11、引起出错的PCR反应条件，在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变完全随机化,易错PCR,优点：简便易行,不足：突变文库规模有限，有益突变少，后续筛选工作费力、耗时，只适用于较小的基因片段（800bp）,DNA改组技术,DNA改组（DNA shuffling），又叫有性PCR（sexual-PCR）等，将单一基因随机片段化，这些片段自配对PCR扩增，由于易错PCR而引入大量随机突变，并在多次循环中重组，使基因在体外迅速进化，从中筛选到有益重组。,优点：体外定向进化，快速，高效（蛋白质、酶、抗体等）,DNA改组技术,基因家族改组,DNA改组的不足：从单一基因出发，得到的随机点突变率
12、很低，且有益突变的积累相对缓慢在自然界中，不同物种同源基因本身就是具有非常丰富的变异，如果加以利用，就可以大大地加速基因在体外的进化速度基因家族改组（DNA family shuffling）,基因家族改组,S3 蛋白质工程制药实例,蛋白质工程在新药研究中的应用胰岛素的蛋白质工程研究,蛋白质工程在新药研究中的应用,1、提高药效活性2、提高靶向性3、提高稳定性、改善药代动力学特性4、提高工业生产效率,5、降低蛋白药物引起的免疫反应6、获得具有新功能的蛋白分子7、获得特定蛋白的拮抗物或类似物8、模拟原型蛋白分子结构开发小分子模拟肽类药物,胰岛素的蛋白质工程研究,胰岛素是治疗糖尿病的特效药1、糖尿病
13、,I型糖尿病：II型糖尿病：,胰岛素抵抗（IR）为主，伴胰岛素相对缺乏；以及胰岛素分泌缺陷，伴IR,由于细胞介导的胰岛B细胞自身免疫性破坏，导致胰岛素绝对缺乏,胰岛素的蛋白质工程研究,闭环系统：自调控竞争解吸附作用,胰岛素的蛋白质工程研究,胰岛素是治疗糖尿病的特效药1、糖尿病,中国4000万，全球1.5亿患者,急性并发症：酮症酸中毒（I，昏迷、死亡）非酮症高渗性昏迷（II）低血糖反应（心慌、手抖、饥饿、出冷汗）,胰岛素的蛋白质工程研究,胰岛素是治疗糖尿病的特效药1、糖尿病,中国4000万，全球1.5亿患者,慢性并发症（可遍及全身各重要器官）：,心血管疾病、慢性肾病视网膜病变、神经病变,胰岛素的
14、蛋白质工程研究,胰岛素是治疗糖尿病的特效药2、胰岛素,胰岛素的蛋白质工程研究,胰岛素是治疗糖尿病的特效药2、胰岛素胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,胰岛素的蛋白质工程研究,胰岛素是治疗糖尿病的特效药2、胰岛素1982年，重组人胰岛素上市第一个基因工程药物！,第一个完成序列测定的蛋白质（1958年）,第一个人工合成的蛋白质（1965年）,Sanger,胰岛素的蛋白质工程研究,胰岛素是治疗糖尿病的特效药2、胰岛素,每100L发酵液就能产生5g胰岛素，使其价格降低了30%-50%!,提取4-5g胰岛素需要100Kg胰腺,胰岛素的
15、蛋白质工程研究,胰岛素在临床应用时存在的问题1、在正常生理情况下胰岛素在体内是不断地分泌的，但不能连续不断地注射胰岛素,2、皮下注射胰岛素时，吸收得也很慢，注射后1.5-2小时，体内胰岛素水平还未能达到高峰，这就会导致高血糖；3-5小时之后胰岛素水平仍在继续上升，这又会导致低血糖,胰岛素的蛋白质工程研究,胰岛素在临床应用时存在的问题3、糖尿病病人一般需要每日四次注射给药,胰岛素的蛋白质工程研究,蛋白质工程技术对胰岛素的改造1970S初，英国的Hodgkin等、我国的梁栋材等，分别用X-射线晶体衍射法进行了高分辨率的三维结构分析，胰岛素的蛋白质工程研究奠定了基础,胰岛素的蛋白质工程研究,蛋白质工
16、程技术对胰岛素的改造1、速效胰岛素（可快速吸收的单体胰岛素）2、长效胰岛素3、高效胰岛素（与受体亲和力增加的胰岛素突变体）,速效胰岛素,胰岛素吸收慢的原因：二聚体、六聚体,速效胰岛素,3D分析发现：多聚体的形成与B8、B9、B12、B13、B16、B23-B28的氨基酸残基有关,用蛋白质工程方法在多聚体接触面上某些氨基酸残基换上带负电的氨基酸残基 B链Ser9 Asp（-），Thr27 Glu（-）由于相同电荷互斥，减少多聚体形成，吸收速度比野生型胰岛素要快许多“速效胰岛素”,速效胰岛素,1996年，第一个速效胰岛素Lispro在欧美批准上市,B链 Pro28 Lys29（）A、自身聚集的倾向
17、大大降低，静脉注射15min起效，1h达到顶峰45min；B、血浆清除迅速（2-4h），减少了引起低血糖的危险。,速效胰岛素,另一个产品：Aspert胰岛素,B链 Pro28 Asp（）A、减少了自身聚集，吸收时间、有效活性都是天然胰岛素的2倍；B、缩短了血浆清除时间，使低血糖的危险降低了50%。,长效胰岛素,pI5.4 6.8，在生理pH下形成结晶，沉淀在注射部位，可缓慢释放出来，这就可以延长体内半衰期,长效胰岛素,实际的研究发现：B链Thr27 Arg，B链C端氨基化，A链Asn2l Gly，血浆半衰期可延长至35.3h长效胰岛素具有较好的临床效果，每天注射一次，可与天然胰岛素分泌水平相近,高效胰岛素,根据已获得的胰岛素分子结构模型和生化工作，人们设计了可以加强胰岛素与受体亲和性的胰岛素突变体，以提高胰岛素的生理活性 B链His10Asp：体外活性比野生型提高了5倍,
