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1、DNA重组和重组DNA技术,起初上帝创造天地，地是空虚混沌，渊面黑暗，上帝的灵运行在水面上，上帝说：“要有光，就有了光。”-旧约全书创世纪,萤火虫的发光基因对烟草说：“要有光”，烟草就发光了。,第 二 节 重组DNA技术,DNA Recombination Technique,本节主要内容,重组DNA技术相关概念 重组DNA技术基本原理及操作步骤 PCR、核酸杂交,DNA克隆工具酶目的基因基因载体,重组DNA技术应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成一具有自我复制能力的重组DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细
2、胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称分子克隆或重组DNA 技术。,基因克隆的主要操作步骤,粘性末端,质粒,目的基因,粘性末端,匹配的粘性末端,分(分离),切(切割),酶切后的目的基因片段,接(连接),连接后的重组质粒DNA分子,大肠杆菌,转(转化),染色体,真好玩!,筛(筛选),分解抗生素的酶,含抗生素的培养基,还活着!,玩完啦!,大肠杆菌,大肠杆菌,大量生长,提取大量质粒,酶切鉴定,基因克隆的基本步骤,分：分离目的基因和载体DNA。切：用合适的限制性内切酶切割上述两者，产生 匹配的末端。接：连接酶将目的基因装入载体。转：转入宿主细胞。筛：筛选具有重组DNA分子的阳性克隆。,限制性核
3、酸内切酶 连接酶 聚合酶(Taq酶、末 端转移酶)多聚核苷酸激酶 碱性磷酸酶,合成双链cDNA分子,5羟基末端磷酸化,切除末端磷酸基,一、工具酶,1.限制性核酸内切酶（restriction endonuclease,RE）,能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。,主要来源于原核生物,由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hin d,Haemophil
4、us influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,分类、（基因工程技术中常用型）,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),舟行水面水行舟,A segment of double-stranded DNA in which the nucleotide sequence of one strand reads in reverse order to that of the complementary strand.In the same strand containing complementary nucleotide sequence with opposite pol
5、arity.,在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（blunt end），如Hpa I：,II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口,切割：以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5 端为磷酸基，3 端为羟基。,在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从 5端切割产生5 端突出的粘性末端，如EcoR：,从3 端切割产生3 端突出的粘性末端。如Pst：,限制性内切酶作用过程,1在下述双链DNA序列(仅列出其中一链序列)中不属于完全回文结构的是 AAGAATTCT B.TGAATTCA CGGAATTCC DCGTTAAGC EAGATATCT,1某识别6核苷酸序列的限制性内
6、切酶切割5AGCTGAATTC3产生 2某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割5CTGCAGAGTC3产生 3某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割5AGGTTAACAG3产生,5 端突出的粘性末端,3 端突出的粘性末端,平末端,常用的载体按来源分为：质粒（plasmid）、噬菌体(phage)和病毒(virus),按得到的产物，载体可分为：克隆载体（cloning vector）主要用于基因片断的扩增表达载体（expression vector）用于获得目的基因编码的蛋白质,（二）载体的分类,载体的选择标准,复制起始点，能自主复制；具有一个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外
7、源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。,质粒（plasmid）,质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞新的遗传性状。因为质粒DNA有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组 DNA操作的载体。,目 录,氨苄青霉素抗性基因,四环素抗性基因,多克隆位点,ori,噬菌体 噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和-DNA组成。噬菌体（lambda bacteriophage）DNA，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补
8、粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。DNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。,lacZ基因:编码-半乳 糖苷酶的-片段,M13噬菌体载体pUC18和pUC19载体,多克隆位点,r,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其 他,三、重组DNA技术基本原理及操作步骤,目的基因的获取,重组DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重
9、组体的筛选,克隆基因的表达,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,目 录,（一）目的基因的获取,1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3.cDNA文库(cDNA library)4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)（见第20章）,*化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽、干扰素基因等。,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切
10、酶,受体菌,基因组DNA文库 P441(genomic DNA library),目 录,cDNA文库的特点代表了取材当时所表达基因的总和，不包括那些未表达的基因。mRNA分子中不包括内含子及调控序列，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。,体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件模板DNA，寡核苷酸引物，dNTPs,DNA聚合酶，合适的缓冲液系统(Mg2+)和DNA变性、复性(退火)及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增.,聚合酶链式反应 P407（Polymerase Chain Re
11、action,PCR）,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,PCR技术的工作原理,目 录,DNA变性 复性 延伸,目 录,理论上可达2n个拷贝原料（pg）产物(g),体外高效、快速、特异 地扩增DNA片段,g mg ug ng pg,（三）外源基因与载体的连接,粘性末端连接 平端连接,（二）克隆载体的选择和构建,粘性末端连接,外源DNA片段与载体用同一种限制性内切酶切割，获得相同的粘性末端，相互互补配对，在DNA连接酶作用下，形成重组DNA分子。,DNA连接酶“缝合”基因的“分子针线”。,DNA连接酶的作用过程,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶1
12、5C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平末端的补齐,3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。如将poly（dA）加到双链DNA片段3 羟基上，而将poly（dT）加到质粒载体3 羟基上，制造出粘性末端，然后通过退火进行粘性末端连接。,受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent),导入方式 转化(tran
13、sformation)将质粒或以它为载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为转化.转染(transfection)将外源DNA直接导入真核细胞.感染(infection)以噬菌体和真核病毒作载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为感染,（四）重组DNA导入受体菌,CaCl2诱导转化,特殊处理,受体细胞,细胞膜特性改变,感受态细胞的制备,基因片段（特别是纯化的DNA）很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预先加以处理，如在低温条件 下，用CaCl2（冰浴）处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率。这种经过预处理、容易导入外源核酸分子的受体细胞被称作“感受态细胞”（competent cell）。,
14、转化后菌落或转染噬菌斑：,（五）重组体的筛选,1.载体遗传标记筛选抗药性标记选择标志补救(marker rescue)2.序列特异性筛选法（1）RE酶切法(2)PCR法（3）核酸分子杂交3.亲和筛选法如免疫化学方法及酶免检测分析等,1）抗药性标志的选择(插入失活法),Amp平板,Tet平板,转化,区别非转化菌与转化菌？,双抗生素对照筛选,重组子能在含有Ap的培养板上生长但不能在含有Tet的培养板上生长,2）标志补救（-半乳糖苷酶法）,lacZ缺陷型的大肠杆菌,LacZ基因 N端序列,插入外源片段（LacZ基因失活）,LacZ基因 C端序列,LacZ酶,互补：单独存在的及 片段都没有半乳糖苷酶的
15、活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有 半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（X-gal）变为蓝色化合物。,目 录,-互补：通过蓝白斑筛选可以筛选、鉴定重组子与非重组子载体,-半乳糖苷酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。,当外源基因插入后，LacZ基因被破坏，不能合成完整的-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成白色。,指用探针检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。,探针：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。,3)核酸分子杂交（molecular hybridization）,菌
16、落原位杂交,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,目 录,3.亲和筛选法,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,分_分离出目的基因及载体DNA。切_利用限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体。接_利用连接酶将目的基因与载体DNA共价连接形成重组DNA分子。转_重组DNA分子转化受体细胞。筛_筛选和鉴定含有重组DNA分子的受体细胞（阳性克隆）。,重组DNA的基本过程,重组DNA技术操作的主要步骤,目 录,大量生长,克隆载体：拷贝大量目的基因表达载体：获得大量目的蛋白,克隆基因的表达,表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化,基因操作的基本步骤,（一）疾病基因的发现与克隆,第三节、重
17、组技术与医学的关系,（二）生物制药,（三）基因诊断,（四）基因治疗,神话成现实 绿叶变为鲜花,基 因 武 器 20克超级基因可使60亿人死于非命,一旦基因武器运用于战争，将使未来战争发生巨大变化。基因武器使用者再也不用兴师动众，而只需要在临战前将经过基因工程培养的病菌投入他国，使敌方人畜在短时间患上一种无法治疗的疾病，从而丧失战斗能力。,基因武器可根据需要任意重组基因，可在一些生物中移入损伤人类智力的基因。当某一特定族群的人沾染上这种带有损伤智力基因的病菌时，就会丧失正常智力。另一方面，基因作为战术武器使用时，将使对方防不胜防，束手无策。基因武器的特有功能之一，就是从武器的使用到发生作用都没有
18、明显的征候，即使发现了也难以破解遗传密码和实施控制。,基因工程生产人的胰岛素的简要过程：,基因工程与医学的关系,普通大肠杆菌,人的细胞,提取,人的胰岛素基因,与运载体DNA拼接导入,大肠杆菌细胞(含人的胰岛素基因),大肠杆菌(产生人的胰岛素),上述过程的关键要解决是什么？,？,基因工程生产人的胰岛素：,关键步骤一：,胰岛素基因从人的细胞内提取出来,关键步骤二：,胰岛素基因与运载体DNA连接,关键步骤三：,人的基因导入受体(大肠杆菌)细胞,限制性内切酶,DNA连接酶,基因工程与医学的关系,大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌,目 录,“非典”可能是针对中国的基因武器,俄罗斯医学科学院院士卡雷辛柯夫在
19、非典疫情大规模爆发初期就断言，非典型肺炎是一种生物武器，极可能是从实验室里流出来的。他的依据是：非典是麻疹病毒与流行性腮腺炎病毒的混合体，而这种混合病毒只有在实验室里才可能培育出来，在自然环境中根本不可能发生。,非典来自生化武器这一观点提出来后，美国政府还曾两次否定非典是美国的生化武器。,基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。,基因治疗(Gene Therapy),基因诊断(Genetic Diagnosis):利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法.,DNA cloningPalindrome
20、Target geneCloning vectorPlasmidRestriction endonucleaseMolecular hybridizationPCR,Key words,Genomic DNA librarycDNA libraryDenaturationAnnealingExtensionExpression vector,Summary,1.何谓基因重组技术，简述其基本过程。2.何谓目的基因，有哪些来源？3.解释基因载体，哪些DNA 可作为基因载体？(质粒)4.基本概念 DNA重组技术,限制性核酸内切酶,回文结构,目的基因,基因组DNA文库,cDNA文库,PCR,核酸分子杂
21、交,第二十一章 DNA重组及重组DNA技术,实验结果,Summary,1.Recombinant DNA technology builds on a few basic techniques:isolation of DNA,cleavage of DNA at particular sequences,ligation of DNA fragments,introduction of DNA into host cells,replication of DNA,and identification of host cells that contain recombinants.,Summa
22、ry,2.A genomic library represents all the DNA of an organism;A cDNA library contains DNA that is complementary to the mRNA from a particular cell or tissue.3.Fragments of DNA generated by restriction endonucleases are incorporated into vectors,which can be plasmids,bacteriophages,viruses,or artificial chromosomes.,Summary,4.Cells containing the desired recombinant are identified by screening.,5.Specific DNA sequences can be amplified by the polymerase chain reaction(PCR).,
