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1、人源肿瘤异种移植(PDX)模型的建立、分析和应用,Fei Zhou,肿瘤研究模型,多样化的肿瘤研究模型病人肿瘤组织/原代肿瘤细胞永生化的肿瘤细胞系2D和3D的细胞生物学实验方法（增殖/存活）来源于肿瘤细胞系的移植模型来源于病人肿瘤组织的移植(PDX)模型 Patient Derived Tumor Xenograft,1,新,传统模型：肿瘤细胞系,可以很方便的在体外进行培养和实验缺点：在培养和传代过程中进行“筛选”，肿瘤细胞逐渐适应体外培养环境而失去原有特性缺乏肿瘤相关的生长环境支持性的非肿瘤基质血液细胞，免疫系统的交互其他肿瘤微环境因子,2,肿瘤研究模型,使用传统的肿瘤研究模型没能取得临床上
2、的成功！肿瘤的多样化和异质性研究模型与临床病人缺乏相关性,3,4,PDX模型技术流程图,Modified Fig from Oncodesign Biotechnology,为什么使用PDX模型？,优势没有体外培养的过程对肿瘤进行“筛选”能搞保持肿瘤原有特性和异质性在传代过程中能够保持分子生物学水平的稳定保留了原有的非肿瘤基质和微环境可以对多种状态下病人来源的肿瘤进行研究,5,PDX模型和肿瘤病人有更好的对应性！,使用PDX模型,劣势仍然不能模拟肿瘤与免疫系统的交互可以在NSG小鼠模型中部分重建人源免疫系统在传代过程中模型的非肿瘤基质会被鼠源的基质逐渐取代使用较低代数的PDX模型进行研究需要相
3、对便捷的临床肿瘤样本来源技术水平上有挑战性移植+分析（包括生物信息学平台）建立和维持的成本较高相对的建成之后的使用价值也非常高,6,PDX模型的建立PDX模型的分析PDX模型的应用,7,PDX模型的建立,关键点肿瘤宿主肿瘤接种肿瘤的冻存和复苏,8,宿主品系,9,宿主品系,目前并没有针对不同品系宿主的完整比较移植瘤生长时间接种成功率移植瘤遗传学特性移植瘤组织学特性移植瘤传代的稳定性模型建立情况与肿瘤类型相关荷瘤小鼠的饲养设施要求（常规为SPF级IVC饲养）完善的IACUC政策,10,肿瘤接种,皮下接种,11,Norman E.Sharpless and Ronald A.DePinho,et a
4、l.Nature Review Drug Discovery 2006,肿瘤接种,使用套针(Trochar)进行皮下肿瘤接种,12,Xiaomei Zhang,et al.Current Protocols in Mouse Biology 2013,肿瘤接种,原位接种常用途径：肾包膜下接种(Sub-Renal Capsule,SRC),13,Peter Eirew,et al.Nature Protocols 2010,肿瘤组织的冻存和复苏,冻存液胎牛血清+10%DMSO保存条件-80oC：6周液氮：长期保存从冻存条件下复苏37oC水浴快速解冻,14,肿瘤组织的冻存和复苏,通过冻存和复苏可以
5、：在获得患者知情同意书之前保存样本保有备份样本进行重复实验,15,PDX模型的建立PDX模型的分析PDX模型的应用,16,PDX模型的分析,目的说明移植瘤与原瘤的相似性确认移植瘤在传代过程中的生物学稳定为PDX模型的应用提供数据支撑,17,需要保存的材料,基因组DNA使用代表性的肿瘤组织区域进行DNA提取如：排除坏死区域等冷冻保存总RNA避免RNA酶污染，一般用试剂盒小心提取，冷冻保存包含mRNA和miRNA蛋白样本（组织裂解液）处理时包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂冷冻保存,18,生物样本库,分析内容 常规,临床背景患者年龄/性别；肿瘤类别，原位瘤/转移瘤；治疗史移植瘤分析生长曲线；药理学特性针对特
6、定药物处理的反应组织学和分子生物学分析原瘤 vs.移植瘤,19,分析内容 组织学,病理学染色（HE染色）确认肿瘤组织结构,20,头颈癌PDX模型维持了原瘤的组织学特性,Peng et al.Journal of Translational Medicine 2013,分析内容 组织学,免疫组织化学染色（IHC）常规标记（如细胞增殖、凋亡）移植的生物标记物（Her2,EGFR,KRAS等蛋白）研究者感兴趣的蛋白,21,Dong Lin,et al.Cancer Res 2013,神经内分泌前列腺癌PDX模型维持了原瘤的蛋白标记,分析内容 组织学,组织芯片(Tissue Micro-Array,T
7、MA),22,Guido Sauter,et al.Nature Review Drug Discovery 2003,分析内容 分子水平,DNA基因序列 第二代测序平台：Illumina HiSeq等基因突变Sequenom OncoCarta Panels V1-3V1：涵盖19个常规癌基因的238个突变位点V2：涵盖18个癌基因或癌抑制基因的152 个突变位点V3:：涵盖22个癌基因的105个突变位点整理过的基因突变数据,23,分析内容 分子水平,外显子组测序外显子捕获Roche SeqCap EZAgilent SureSelectIllumina TruSeq使用第二代测序平台进行外
8、显子组测序需要有整合的生物信息学分析平台针对PDX模型对二代测序结果分析进行优化对识别变体的方法进行优化和验证根据需要开发个性化的数据分析方法,24,分析内容 分子水平,外显子组测序,25,右图为Oncotest公司使用外显子组测序结合生物信息学分析方法整理出的23个PDX模型中507个癌症相关基因的突变频率。每一个扇区代表了一种肿瘤类型；热度图指示了该肿瘤类型中某个基因的突变频率。Krzywinsky,M.et al.Circos:an Information Aesthetic for Comparative Genomics,Genome Res(2009)19:1639-1645,分析
9、内容 分子水平,RNA基因表达谱 Affymetrix HG-U133 plus 2.0 Array单核苷酸多态性(SNP)和拷贝数变异分析 Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array V6.0miRNA表达数据 miRNA array,26,分析内容 分子水平,蛋白表达（蛋白标记）蛋白免疫印迹 Western Blot免疫组织化学染色 IHC荧光原位杂交(FISH),27,肝癌PDX模型的蛋白表达分析。Hung Huynh,et al.Cancer Res 2006,PDX模型的建立PDX模型的分析PDX模型的应用,28,新药开发和筛选研究PDX模型对于药物处理的反应分子标记物开发(Biomarker)药物反应 分子生物学机制个性化治疗分子生物学机制 针对性的治疗方案,29,PDX模型的应用,PDX模型的应用,30,建立PDX模型进行生物标记物的开发来实验个性化治疗,Tentler,J.J.et al.Nat.Rev.Clin.Oncol.(2012),PDX模型的应用,分子标记物(Biomarker)的开发流程,31,
