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1、遗传病的诊断,第一节、遗传病的常规诊断和临症诊断：常规诊断：指除分子诊断之外的一切用于遗传病的诊断方法，包括实验室方法，临床方法和遗传学方 临症诊断：根据患者的各种临床表现进行分析确诊并判断遗传方式，是遗传病诊断的主要内,遗传病诊断的主要内容和方法(指临症诊断）一、病史采集：原因：主要考虑到家族聚集性和传递规律 目的：获得更有用的信息 要求：真实性和完整性：发病的原因、过程、时间、地点、诊断情况二、症状与体征：症状与体征是就诊的主要原因，也是临床上获取第一手信息资料的渠道。,三、家系分析：从先证者入手，对其直系、旁系进行尽可能多的全面谱查，依据AD、AR、XD、XR、多基因遗传和Chr病以及其
2、它影响因素,如环境因素、单基因遗传影响因素等，综合分析、确定遗传病的类型、传递方式、提出再发风险。四、Chr检查（细胞遗传学）：Chr病是遗传病中的一大类，Chr检查就是确诊这类疾病的有效手段，是确诊Chr病的主要依据。,1、Chr检查的指征：明显的生长发育异常，多发畸形，智力低下 多发性流产和不育夫妇 性腺以及外生殖器官发育异常者 原发性闭经 35以上高龄孕妇 已生有Chr异常患儿的夫妇 身材高大，性情粗暴的男性 恶性血液病患者 长期接受X线、紫外线、电离辐射人员,2、Chr检查技术：方法：人外周血小淋巴细胞（处在G1期或G0期）骨髓、胸腹水、活检组织（如绒毛膜）、手术取材的肿瘤、羊水等 技
3、术：人类Chr常规核型分析 人类Chr显带核型分析,五、生化检查：1、检查内容：遗传病诊断中的重要辅助手段，包括临床生化检查和遗传病的特异检查。2、检查的目的：检测蛋白质和酶结构和功能活性，适应于分子病、先天性代谢缺陷、免疫缺陷以及反应底物、中间产物、终产物和受体与配体的检查。,3、检查的材料：血液、活检组织、尿、粪便、脱 落细胞、阴道分泌物。4、方法：电泳速率、酶动力学、指纹分析、免疫反 应，以上主要检测酶变型。检测Pr变型：电泳技术，肽链和氨基酸顺序。检测代谢中间产物：如测定尿中苯丙酮酸或 苯乙酸可诊断苯丙酮尿症；中间代谢产物的 检测是目前临床采用的生物化学检测方法，主要是检测酶缺陷和代谢
4、中间产物。,由于血和尿液易于采集，加上方法学的不断改进，目前已制成滤纸片和显色反应进行检测。六、基因水平诊断：直接检测等位基因类型，或检测与致病基因紧密连锁的具有多态性的遗传标志，从而能准确判断携带者（第三节讲解）。,第二节、产前诊断（出生前诊断）,产前诊断：又称宫内诊断，是对胚胎或胎儿在出生前 是否患有某种遗传病或先天畸形做出准确 诊断。一、产前诊断的对象：1、夫妇之一有Chr畸变，特别是平衡易位携带 者，或夫妇核型正常，但生育过Chr病患儿的 夫妇。2、35岁以上高龄孕妇 3、夫妇之一有开放性N管畸形，或生育过这种畸 形的孕妇。4、夫妇之一有先代病或生育过此类病患儿的孕妇。,5、X连锁遗传
5、病基因携带者孕妇 6、有原因不明的习惯性流产史的孕妇 7、羊水过多的孕妇 8、夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇 9、具有遗传病家族史，又系近亲婚配的孕妇,二、产前诊断的方法：包括母体的血清与尿液分离、B超、X射线、CT、磁共振、羊膜穿刺法、绒毛取样法、脐带穿刺术、胎儿镜检查等，其中X与B超属影像学检查最常用、最简便。1、B超：能详细检查胎儿的外部形态和内部结构，可通过某些细胞微改变提示Chr异常，使胎儿遗传病得以早期诊断。如：,中枢N系统异常：N管缺陷（NTD），脑积水、小脑畸形。面、颈部异常：如唇裂、腭裂、颈部囊状淋 巴管瘤、先心病、肺发育畸形等。股骨短小和颈部皮褟增厚：提示21三体征，此特性
6、敏感性为82%，特异性98%。脐动血流异常或单根脐动脉：提示Chr异常。肢体缺陷：先天性肾缺如、肾囊肿、先天性巨 结肠等。B超检查对胎儿、母体无害，直观、常见、首选。,2、X线检查：胎儿骨骼在20周后开始骨化，所以在24周后对胎儿进行X光检查为适宜；X光检查：无脑儿、脑积水、脊柱裂等骨骼畸形。3、分离孕妇外周血中胎儿细胞(富集)：临床上获取胎儿细胞的方法会对母体和胎儿有一定损伤，都有流产或感染的风险，而从母体外周血中获取胎儿细胞的方法最安全。现代医学分子生物学研究发现母体中含有胎儿的细胞。这一技术的关键是怎样从母体外周血中分离（分选）胎儿细胞。,疑点：胎儿细胞是怎样到母体外周血中 的，这是对传
7、统医学的挑战。如何穿过羊膜、不同（母胎）血型抗原不同、组织 相溶性的抗原问题。4、羊膜穿刺术：在B超监下取胎儿羊水。时间：16-20周。目的：性别鉴定、染色质和核型分析、DNA分析。特点：风险小，对胎儿刺激小，常用,流产率 2.5%。,5、绒毛取样法（CVS）：在B超监视下进行。时间：7-9周。目的：性别鉴定、核型分析、生化检查、DNA分析。方法：用特制塑料或金属管从阴道经宫颈进入子 宫，再沿子宫壁到达预定的取样位置即胎盘 处，用内管吸取绒毛组织，因绒毛组织中含 大量处于分裂期的C。特点：易感染，优点是时间早，便于选择，流产 率：7%。另：经腹壁获取绒毛，感染风险降低。,羊膜穿刺,绒毛取样法,
8、6、脐带穿刺术：在B超监视下进行,时间：18周。目的：同上。方法：用细针经腹壁，子宫进入胎儿脐带，抽取一定数量的胎儿血液，培养Chr分 析，流产率1%。7、胎儿镜检查：又称羊膜腔镜检查，可以直接观察胎儿的外形、性别和发育状况，又可以抽取羊水或胎血，还可以进行宫内治疗。时间：18-20周。特点：操作困难，易引起并发症。,8、植入前诊断:主要针对试管婴儿,在受精6天胚胎着床前通过显微技术取一个细胞,应用PCR、FISH技术进行特定基因和染色体畸变的检测，将遗传缺陷和遗传病掌控在最早阶段。,第三节、基因诊断（分子诊断）,一、概念：基因诊断是用分子生物学方法在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，
9、从而对特定的疾病进行诊断。从广义上说，凡是用分子生物学技术对生物体的DNA序列及其产物（RNA和Pr）进行定性、定量分析都称为分子诊断；通常又将针对DNA的分子诊断称为DNA诊断或基因诊断。目前的分子诊断方法主要是针对DNA分子，涉及到功能分析时需定量检测RNA（主要是mRNA）分子，由于分析技术相对复杂，目前很少将蛋白质分子作为常规分析对象。,二、基因诊断的特点 以特定基因为目标，检测基因的变化，特异性；采用分子杂交技术和PCR技术具有信号放大作用，用微量样品即可进行诊断，灵敏度高；常用在疾病尚未出现临床表现前，胎儿出生前的产前诊断。,三、基因诊断常用技术和方法：1、核酸分子杂交 即具有互补
10、碱基顺序的DNA或RNA单链在适合的条件下能够相互结合成双链，称核酸分子杂交，是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是利用核酸变性和复性理论：即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构，因杂交需在一支持膜上(NC)进行，因此又称为核酸印迹杂交。,1、DNA印迹杂交（Southem blot）DNA印迹杂交步骤：待测细胞DNA纯化（提取）酶切：利用RFLP 电泳：利用琼脂糖凝胶电泳，分离DNA片段 转移：用吸印法将凝胶片段移到硝胺纤维膜上 变性：加热80度使DNA变成单链，并固定在膜上 杂交：用标记的探针杂交 冲洗：去掉膜上杂交
11、的探针 放射自显影：冲洗观察结果（带有杂交分子的滤 膜与X片贴在一起）,原理：一条已知的核酸探针分子在一定条件下与结合在固有支持物上的具有一定同源性的DNA分子可以完全或部分退火形成双链，通过检测探针信号，就可以对检测DNA进行定性或半定量分析。“核酸探针”：是指酸分子上带有可被检测的信号分子，如荧光物质标记的核酸分子,常用的核酸探针主要包括：cDNA探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针（ASO）和RNA探针。,2、RNA印迹杂交（northem blot）即定性分析mRNA 的常用方法，其程序与southem blot类似，所采用的探针一般也是DNA探针，只是被检测物质是RNA分子。3、原位
12、杂交（也即荧光原位杂交FISH）原位杂交的定义和步骤：如果将已知碱基顺序的DNA片段用标记物质标记成探针，那么被测DNA与探针之间的杂交结果很快显示出来。,如果将核酸分子杂交过程在固定的染色体标本上进行，称“原位杂交”；特点是杂交在显微镜载玻片的中期Chr标本上进行，所谓“原位”是指Chr DNA原位变性，在整个杂交前后，Chr标本及所有DNA不改变位置。其步骤是：将用放射性同位素或非放射性物质（如生物素、地高辛）标记好的基因探针直接滴加到经过变性处理的Chr上，探针会按碱基互补原理结合到Chr上相应的基因位点上进行杂交。,最后在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，通过观察荧光信号的颜色和数
13、目的异常，达到疾病诊断的目的;如利用FISH技术检测乳腺癌的诊断率达100%。又如白血病等许多恶性肿瘤与Chr特定片段的缺失、易位和重排有关；利用FISH能准确反映出Chr上片段的易位和重排。,2、聚合酶链反应PCR技术（属常用技术）PCR技术是获取目的基因的一种方法。其原理是：PCR技术是根据DNA半保留复制和DNA聚合酶的特性建立起来的；PCR技术是在试管中完成的DNA复制；所不同的是：PCR技术中模板DNA是在940C高温下变性，且在耐高温的Taq DNA聚合酶催化下完成新链DNA合成；由于反应中的产物又在新一轮反应中作为模板，模板数目不断增加，最后达到DNA扩增的目的。,PCR通过变性
14、、退火、延伸的循环周期，使特定的基因或DNA片段（目的基因）在短短2-3小时内扩增数十万至百万倍，大大缩短了诊断是时间。PCR技术通常结合其它技术进行诊断 1、PCRRFLP（限制性内切酶片段长度多态性）是将聚合酶链反应与RFLP结合的一种检测技术，是利用RFLP与突变基因的连锁关系对基因进行连锁分析。1978年首先用此技术检测出胎儿镰状细胞贫血（B5）基因，RFLP称为第一代遗传标志。RFLP：即限制性内切酶片段长度多态性,RFLP定义：指人群中不同个体基因的核苷酸序列存在差异，称DNA多态性；DNA序列上发生变化或丢失某一限制性内切酶位点，使酶切产生的片段长度和数量发生变化称为RFLP。,
15、不同的限制酶在人类DNA分子上都有其特异的识别和切割点，由限制酶切割DNA分子所产生的片段就称限制性片段。同是人的DNA，用同一种限制酶消化，所产生的限制性片段应该相同，事实上用同一种限制酶处理不同个体的DNA分子，往往产生不同长度的片段（DNA多态性），也称RFLP。任何一个基因内切片段的缺失、插入以及基因重排，即使不影响到限制内切酶位点的丢失或获得，也可能引起限制性内切酶图谱的变化，使限制性内切酶片段的大小和数量发生变化，因而这类基因突变可以通过限制性内切酶DNA或结合基因探针的杂交方法将突变找出。,“限制性内切核酸酶”就是指能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类
16、内切酶。例如：苯丙酮尿症连锁基因的诊断（PKU）：该病源于PAH酶缺乏，即PAH基因突变所致；PHA基因定位于12q2212q24.1.全长90kb，现用Msp1限制性内切酶对正常的PAH基因组DNA进行切割，产生了多态性片段，因不同的个体切点不一样，一般2-3切点，这里主要产生23kb或19kb片段，当利用这种多态性对PKU分析时，发现PAH基因（突变）与19kb片段连锁。RFLP连锁分析法就是利用有关基因的DNA探针间接探测与RFLP紧密连锁的缺陷基因，当RFLP与待测的基因紧密连锁时，就可以将这些RFLP作为遗传标记，从而进行基因诊断。,原理：PCR：利用一对或数对特异性产物将目标 DN
17、A扩增；酶切：利用限制性内切酶消化PCR产物，如 RCR产物中含有相应的酶切位点序 列、DNA链则被切开；电泳：根据电泳图判断结果 2、PCRASO：ASO为“等位基因特异性寡核苷酸”，是 核酸杂交的一种方法。,方法:PCR：将目标DNA扩增，杂交：利用人工合成的已标记的ASO探针（常有几十或19个碱基左右长度）与PCR产物杂交，根据杂交信号进行HLA多态性断判，如果PCR产物中的序列与探针序列完全配对，则出现典型的杂交信号，如果不完全配对，杂交信号将明显减弱甚至消失。,3、PCRSSCP SSCP是“单链构象多态性”。原理：当双链DNA变性为两条单链后，各自会在中性条件下形成特定的空间构象，
18、电泳时出现各自的电泳条带，如果DNA发生变化，甚至只有一个碱基变化，空间构象也可发生变化，电泳条带也可随之变化。方法：PCR：目标DNA扩增；变性：即将PCR产物在变性缓冲液中加热变性；电泳：即将已变性的PCR产物进行电泳，根据电泳条带，判断DNA序列变化。,3、DNA测序：即测定DNA核苷酸序列。4、基因芯片技术基本原理：(核酸杂交)。方法：将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，形成矩阵点（称微阵）,（12上排列成千上万个点），将目标DNA/RNA通过PCR扩增，体外转录并掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原则进行杂交，再通过荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以
19、计算机系统对每一个探索针上的荧光信号作出比较和检测，得出所要的信息。,基因芯片原理标准解读：DNA芯片的原理是利用微点阵技术，将探针通常是（DNA或cDNA）以高密度点阵的形式按一定的顺序固定排列在12的硅片上（或玻片、尼龙膜）表面上，再将所研究的样本材料如DNA、RNA或cDNA用荧光标记，在芯片上与探针杂交，然后通过激光共聚光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，并配合计算机进行分析，从而快速、准确得出所需信息，只需一次实验，DNA芯片便能够将成千上万的基因表达图谱记录下来。,三、分子诊断技术的应用 1、对遗传性疾病的诊断：如已知镰状红细胞贫血症的突变基因是编码珠蛋白链的第6位密码子，由GAG变为GTG，可用限制性内切酶Mst进行检测，因为这一突变使正常存在的Mst切点消失，这就使正常情况下存在的1.1kb及0.2kb条带变成患者（纯合子）的1.3kb条带。即：-珠Pr-6号位GAGGTG酶切位点消失，正常的1.1kb和0.2kb条带变成了患者1.3kb条带。,2、对肿瘤的诊断 如:肺癌、乳腺癌、直肠癌等 对ras基因突变的检测 P53基因的检测3、DNA分型（参阅第十五：HLA DNA分型）4、帕金森病基因诊断的研究进展,
