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1、生物化学检验中酶的测定,广州医学院医学检验系临床生化教研室,前言,酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类。绝对定量法是通过特异试剂与酶作用直接测定酶蛋白量或酶分子浓度的方法。相对定量法是根据酶的催化活性或酶促反应速度来间接测定酶浓度的方法。目前临床上所用的方法多属相对定量法。,本节内容,一、酶活性浓度的测定二、酶质量浓度的测定三、同工酶及其亚型测定四、酶活性浓度测定的主要影响因素及控制,酶活性浓度的测定,主要内容,酶活性浓度测定的基本原理酶活性浓度的测定方法底物或产物浓度的检测酶偶联反应法工具酶与共通反应途径酶活性浓度的单位,酶活性浓度测定的基本原理,酶催化活性的途径,酶催化活性可通过测
2、定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得。用这种方法获得的酶浓度的确切名称是“酶的催化活性浓度”或简称为“酶活性浓度”。,酶活性与反应速率的关系,若SKm，且S很大，米-曼氏方程式可简化为：此时，酶促反应的最大速度只与酶催化活性或酶量E成正比例，它是建立准确、可靠测定方法的基础。,酶促反应过程的分期,一个典型的酶促反应过程一般包括三个阶段。延滞期（lag phase）、线性期（linear phase）非线性期（non linear phase）,酶促反应时间进程曲线,注意事项,要准确测定酶活性，必须了解不同酶反应速率和时间的关系，找出酶促反应速率恒定的
3、时间，避开延滞期、非线性反应期。传统的手工分析法无法在零级反应期测定，故结果不够准确。,酶活性浓度的测定方法,酶活性浓度的测定方法,以反应时间为依据，酶活性浓度测定方法可分为两大类定时法（fixed time assay）连续监测法（continuous monitoring assay）,定时法,通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。,定时法中酶促反应的过程,注意事项,用定时法测定酶活性浓度，必须了解不同酶促反应速率和时间的关系，应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间，然后在这段时间进
4、行测定，避开延滞期和一级反应。,连续监测法,连续监测法是指每隔一定时间（260s），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。,连续监测法的测定时间,注意事项,自动生化分析仪能自动获取规定时间内的信号，自动判断非线性度，所以连续监测法更适合于自动化仪器。目前已取代固定时间法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法。,底物或产物浓度的检测,底物或产物浓度的检测,在酶活性测定方法中，无论是定时法还是连续监测法，酶促反应速度都要通过测定底物或产物来实现。依据酶促反应中底物或产物的理化特性质及检测方法，酶活性浓度测定的方法可分为直接法和
5、间接法。,直接法,这类方法是在不终止酶促反应条件下，通过特殊的仪器直接测定反应体系中底物或产物的理化特性变化量，如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、粘度等，从而计算出酶活性浓度的方法。,基于NADH或NADPH理化特性的测定方法,利用NAD(P)H在340nm处的吸光度值的变化，测定各种脱氢酶的活性，该法是目前应用最广的一类方法。,基于人工合成色素原底物理化特性的测定方法,一些水解酶类或转移酶类可通过酶促反应将化合物中的某一基团水解或移去，使无颜色的底物转变为有颜色的产物。人们把这类底物称为“色素原”底物。根据这一原理，人们设计合成了一系列底物用来测定酶活性。,间接法,间接法是指酶促反应底物
6、和产物之间没有特征性的理化性质，需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物，然后进行测定的方法。,化学法,大多数是在酶促反应终止后加入另一个试剂与底物或产物反应，转化为有色化合物，再用分光光度法检测。部分酶类是在原来反应体系中加入一些与酶促反应无关的试剂，这些试剂只和酶促反应的某一反应物迅速作用，产生可被仪器检出的有特征性物质，但同时又不和酶作用也不影响酶活性。,酶偶联法,是目前在酶活性测定中应用最多，最为广泛的方法。即在原反应体系中加入另一些酶试剂，将所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。在临床常规酶学分析中，以NAD（P）H为辅酶或辅基的脱氢酶，以及
7、过氧化物酶（POD）是常用的酶偶联法的酶试剂。,酶偶联反应法,酶偶联反应式,酶偶联反应法的基本原理,在酶活性测定时，如果底物或产物不能直接测定或难于准确测定，可采用酶偶联法测定，即在反应体系中加入一个或几个工具酶，将待测酶生成的某一产物转化为新的可直接测定的产物，当加入酶的反应速度与待测酶反应速度达到平衡时，可以用指示酶的反应速度来代表待测酶的活性。,酶偶联反应法的反应进程,用酶偶联法测定酶活性浓度时，酶促反应进程存在四个时相：预孵育期或预温期。延滞期。稳态期或恒态期。非恒态期。,酶偶联法的吸光度变化示意图,注意事项,应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。只有此
8、阶段的吸光度才会有明显线性变化。,工具酶与共通反应途径,工具酶,在酶学分析中，作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。常用的工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类，但以氧化还原酶类更多见，因为其产物最易被直接监测而成为指示酶。,共通反应途径,在临床生物化学检验中，许多项目的测定往往使用有工具酶的参与的类似的反应原理，即所谓共通（或通用）反应途径。,两类常用的通用反应途径,NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应偶联H2O2的工具酶及其指示反应,酶活性浓度的单位,酶活性浓度的单位,酶活性单位惯用单位，国际单位（IU），Katal单位;酶活性浓度单位酶活性浓度以每单位
9、体积所含的酶活性单位数表示。U/L。,正常上限倍数,正常上限升高倍数（upper limits of normal,ULN）是指把酶测定值转换为正常上限值的倍数。简单地说，就是用测得的酶活性结果除以参考范围的上限值。,酶质量浓度的测定,酶浓度,严格来说是指酶分子的质量浓度，常以酶蛋白浓度来表示。人体体液中的酶有几百种，除LPS、LCAT、ChE、铜氧化酶（CER）外，大多数酶的含量在g/L水平甚至更低。因此，酶活性浓度的测定是目前主要测定方法。20世纪70年代以后，随着新技术特别是免疫学技术的发展，酶的定量分析技术中出现了许多利用酶蛋白的抗原性，通过抗原抗体反应直接测定酶蛋白质量的新方法。,酶
10、蛋白浓度测定的方法,国内外曾使用电泳法、柱层析法、免疫化学法等测定酶浓度，其中以免疫化学法应用较广。免疫化学法是利用酶蛋白的抗原性，制备特异性抗体后用免疫学方法测定酶浓度。,酶浓度测定的免疫化学方法,免疫抑制法、免疫沉淀法、放射免疫测定（RIA）、化学发光免疫测定（CLIA）、酶免疫测定（EIA）、荧光酶免疫测定（FEIA）等。其中，前两种方法可用于酶活性浓度测定，其他方法则用于酶蛋白浓度测定。例如，如免疫抑制法测定CK-MB的活性、免疫沉淀法（单向扩散法）法测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性；RIA测定胰蛋白酶和弹性蛋白酶浓度、CLIA测定CK-MB的浓度、ELISA测定神经元特异性烯醇化酶
11、（NSE）浓度等。,CK-MB,是诊断AMI、测定心肌梗塞面积的重要指标。近年来，国外对AMI诊断效率评价时多采用测定CK-MB质量，即测定CK-MB的酶蛋白质量浓度（Mass）的方法。CK-MB质量的测定通常是制备抗CK-M抗体和抗CK-B抗体或采用CK-MB抗体，用CLIA、ELISA、FEIA等方法测定。,CK-MB,这些方法适用于临床自动化分析，具有测定时间短（最快仅需7min）、灵敏性高（最低检测限g/L）和准确性好的特点，明显优于其他分析测定CK-MB的方法，1990年后逐渐被广泛接受。为使CK-MB质量分析标准化，AACC成立了专门的标准化委员会，最近已研制成功采用重组基因技术的
12、CK-MB参考材料（Rck-2）。,注意,由于酶浓度测定方法的不同，报告方式也有差异酶活性浓度单位常以U/L报告，酶质量（mass）浓度单位常直接用ng/ml或g/L报告。,免疫化学法测定酶浓度的优缺点,灵敏度高，灵敏度达到ng/至g/的水平，能测定样品中用原有其他方法不易测出的少量或痕量酶；特异性高，几乎不受体液中其他物质，如酶抑制剂、激活剂等的影响，不受药物的干扰；,免疫化学法测定酶浓度的优缺点,能用于一些不表现酶活性的酶蛋白的酶测定，如各种酶原或去辅基酶蛋白，或因遗传变异而导致合成无活性的酶蛋白，以及失活的酶蛋白等；在某些情况下，与酶活性测定相结合，计算免疫比活性，能提供更多的具有临床应
13、用和研究价值新的资料和信息。特别适用于同工酶的测定。,酶的免疫化学测定的局限性,要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的，而且工作量很大；测定步骤多，操作繁琐；测定成本高。,同工酶及其亚型测定,主要内容,同工酶的概念电泳法色谱法免疫分析法动力学分析法蛋白酶水解法,同工酶的概念,同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的一组酶称为同工酶。凡酶蛋白结构不同的同工酶称为原级同工酶，而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶或酶的多种形式。,同工酶的测定,由于
14、同工酶（及其亚型同工型）一级结构的不同，导致其在理化性质、催化性质、生物学等方面有明显的性质差异，这些差异为同工酶的分析和鉴定提供了理论基础。临床同工酶的分析大致可分为两步，即首先精确地分离出某酶的各同工酶组分，然后测定酶的总活性和各同工酶组分的活性。,电泳法,在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最为广泛。目前所采用的电泳方法大致可分为显微电泳、自由界面电泳和区带电泳三大类。临床上以区带电泳最为常用。,区带分离,用电泳法进行区带分离的原理与其他蛋白电泳相似。可用的支持物虽多，但目前的实验室多用醋酸纤维素薄膜（简称醋纤膜）、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持介质。国内外的一些自动化电泳分析
15、系统则多采用分辨率更高的琼脂糖凝胶作为支持介质，采用高压或常压电泳进行各种同工酶及其亚型的分离与鉴定。,活性显色,经电泳分离后的同工酶区带需用酶反应染色法进行显色。不能直接显色者可加入工具酶经偶联反应显色。如果产物（或经偶联反应后）能显荧光者亦可用荧光法检测。电泳法同工酶的显色与一般蛋白质不同，需依赖其催化活性，因此，不能经过固定步骤，呈色产物要求非水溶性。,常用的显色系统,重氮试剂染料：人工合成的萘酚或萘胺衍生物在酶促反应后产生的萘酚或萘胺与偶氮染料如固蓝等生成难溶于水的有色的重氮化合物。如ALP、GGT同工酶的测定。,常用的显色系统,电子传递染料：脱氢酶反应产生NAD（P）H，其中+经PM
16、S传递+，交给四氮唑盐生成不溶性有色的甲臜化合物。如LDH同工酶的测定。,常用的显色系统,脱氢酶偶联的指示反应：如AST、CK等,检测结果,显色后的区带一般用光密度计或荧光计扫描定量分析。,正常和病理状况时血清LD 同工酶的琼脂糖凝胶电泳分离图谱,注意事项,用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。,色谱法,色谱法又称层析法、色层法或层离法，是一种以物理化学原理为主的分离分析方法。常用于分离同工酶的色谱法是柱色谱，但方法费时繁琐，通常不适合临床同工酶常规检测。目前国外已有供临床同工酶分析用的商品化微型色谱柱。,免疫分析法,可应用于同工酶检测的免疫分析
17、法有免疫抑制法、免疫沉淀法、免疫电泳法、放射免疫法和酶联免疫吸附法等，其中应用较多的是免疫抑制法、免疫沉淀法和免疫电泳法等。,免疫抑制法,利用同工酶的一种亚基与相应的抗体结合后，该亚基的酶活性受到抑制，测定加与不加抗体前后样品中酶活性的变化，可以计算出该亚基型同工酶的活性。临床曾常规采用此法测定血清中CK-MB同工酶。足量的抗CK-MM的血清可将CK-MM完全抑制，CK-MB因有50%为M型亚基，也被抑制50%，而CK-BB（血清中无CK-BB或仅有痕量时）则不受影响，,计算,不加抗CK-MM血清时样品的CK活性=CK-MM和CK-MB活性；加入抗CK-MM血清时样品的CK活性=50%CK-M
18、B的活性；加入抗CK-MM血清时样品的CK活性2=CK-MB活性；所测CK-MM和CK-MB之总活性CK-MB活性=CK-MM活性。,优缺点,本法无需分离抗原抗体复合物，测定快速，操作简单，适合于急诊及大批样品的自动化测定。但该方法准确性欠佳，如样品中含有较多的CK-BB时，本法不能适用。巨型CK-MM也不被抑制。,免疫沉淀法,利用分离提纯的同工酶作抗原制备相应的抗体；将该抗体与含该型同工酶的待测样品混合，在一定条件下可形成抗原抗体免疫复合物沉淀，离心后便可测定上清液中其他型别的酶活性。将加入抗体前测得的总活性减去上清液酶活性，即可求出被沉淀的同工酶的活性。这类方法可用于检测前列腺ACP（PA
19、P）和胎盘ALP。,其他免疫学方法测定酶蛋白,酶是蛋白类抗原，但由于含量极微，常使用免疫电泳、RIA、EIA和CLIA等灵敏度较高的方法。这类方法的最大特点是与酶活性无关，已用于检测CK-MB、LD1、PAP、骨-ALP、P-AMY等。,动力学分析法,动力学参数的测定是同工酶研究中不可缺少的部分，有些动力学分析法因其简便易行而应用于临床实验室。如底物特异性分析法、特异性抑制分析法、最适pH分析法、热失活分析法、特异性激活分析法等。动力学分析法虽然简单、快速、无需特殊设备，但准确性较差，不易找到只作用于同型同工酶的抑制剂、激活剂或其他条件。,蛋白酶水解法,利用蛋白酶特异地水解某型同工酶肽链上的特殊键，使其立体构象或全部发生变化而失活，从丧失的活性可测知该型同工酶的活性。如LD同工酶、AST同工酶等。此法快速、简便、准确、易于自动化分析。,谢谢,
