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1、第六章 免疫电镜,常规电镜：形态结构免疫学方法：组分免疫电镜：形态结构+组分免疫电镜延伸了免疫光镜,细菌，冰冻超薄切片，免疫标记腺苷酸环化酶，醋酸铀染色,双标记菌毛上两种抗原，胶体金5nm,20nm,免疫电镜要解决的两个问题,免疫电镜标本的结构保存与抗原活性保存问题二者经常矛盾在电镜下显示抗体的合适的标记物,1低温包埋超薄切片法制备免疫电镜标本,1 取材与固定 目的 将所取样本尽可能固定在生活状态下，并保存样本的抗原活性,固定剂,固定液,4%FA(in 0.1M PB)或4%FA+0.010.5%GA(in 0.1M PB)免疫光镜预实验,取材FA+GA固定液中4C 23h(中间1-2h可取出
2、修块)封闭游离醛基（0.5M NH4Cl in 0.1M PB）4C 2h冲洗（0.18M蔗糖in 0.1M PB）4C 2h或过夜中间换液23次*常规电镜标本可在冲洗液中存放12周，但免疫电镜标本不行，因为GA浓度很低微细结构变化大,2 脱水,目的去除样品中的水，为包埋剂（水溶性）的均匀浸透做准备脱水剂：乙醇，甲醇，异丙醇，乙醚，或丙酮（梯度脱水）,脱水剂对抗元的灭活作用随温度降低，但不能低到脱水剂结冰的温度，所以应选择结冰温度低的脱水剂预先冷却好全部用具,3 浸透与包埋,目的使包埋剂浸透样品后，固化成硬块,包埋剂,（几类物质的混合物）羟丙基甲基丙烯酸酯（基本成分）乙二醇丙烯酸酯（交连固化剂
3、）苯甲酸烷基乙醚（激活剂）,Lowicryl K4M(德国),LR White(英国),低温（-20-40 C),紫外光照射下,自由基链式反应,常规与免疫电镜包埋剂比较,化学活性亲水性固化条件,称量要准确，尤其量少的胶拌时避免产生气泡（O2自由基聚合阻聚剂）使用无色透明胶囊（无色明胶或聚酯胶囊）包埋剂加满加盖用具全部预先冷却,注意事项,紫外照射聚合箱,紫外灯：波长360-365nm，N=12W-20-40 C,24h,RT2-3d保存：干燥器（-20 C）可保存很长时间，取出时连同干燥器一同移至室温下，达到室温后再拿出,4 切片,亲水性包埋剂切片与非亲水性包埋剂切片技术要领上有所不同,切片存放
4、,5 免疫标记,（略）,6 免疫标记后染色,1.8%醋酸铀+0.2%甲基纤维素,RT,5m*不宜长时间冲洗（控制在510s），易脱色*任何一步都不能让载网干,2冰冻超薄切片法制备免疫电镜标本,特点：简便，快，抗原活性保存好 结构保存相对差，价格贵,1 取材与固定,固定目的将各种组分尽可能固定在生活状态下，醛固定后蔗糖可渗透细胞FA(24%)+GA(0.010.5%)固定液中4C 23h(中间1-2h可取出修块)冲洗（0.18M蔗糖in 0.1M PB）4C 2h或过夜，中间换液23次,*固定时间越长，结构保存越好，抗原活性保存越差*对于可溶性的物质（细胞溶质，分泌蛋白）需加GA以避免免疫反应过
5、程中可溶性的物质被抽提*对于膜或细胞骨架上的物质而言，可溶性物质的被抽提有利于膜或细胞骨架上物质的接触免疫标记物,2 冷冻保护,将标本块转移到蔗糖（2.3M in 0.1M PB）溶液中，不少于30m,3 冷冻,将标本块固定到样品架上，并一同在液氮中冷冻，然后将样品架迅速转移到冷冻切片室中（-90-110 C）,4 冰冻超薄切片,在冰冻超薄切片机上进行*玻璃刀，钻石刀,粗0.2mm不锈钢丝，园环直径2mm 蔗糖2.3M in 0.1M PB,0.5m,半薄切片相差显微镜,50100nm,超薄切片,2%明胶(in 0.1 M PB)吸走蔗糖,减少背景等待免疫标记（存几个小时）,切片存放,明胶湿室
6、,免疫标记过程中，切片面浸湿，载网背面干燥载网浮在液滴上,5 免疫标记,6 免疫标记后染色,染色液：4%醋酸铀+0.3M草酸（与醋酸铀等体积），用5%NH4OH调pH至77.5RT,5m,7 甲基纤维素包埋,目的:防治干燥时产生皱缩2%甲基纤维素水溶液+24%醋酸铀（使醋酸铀最后的浓度为0.10.4%）,用不锈钢环捞出，滤纸吸水，干燥,所形成甲基纤维素的最终厚度与结构保存和图像反差关系密切，干涉色呈金色，蓝色适宜 厚，结构保存好，牺牲图像反差 薄，图像反差好，留下干燥带来的违迹厚度取决于移走的甲基纤维素溶液量,3 电镜下显示抗体的标记物胶体金,热力学稳定,热力学稳定,热力学不稳定,1 胶体（金
7、）概念及性质,溶胶的重要特征：微小的颗粒，颗粒越大越不稳定胶体金：1100nm(80nm红，80nm兰)制备：工业 实验室 HAuCl4+（单宁酸+柠檬酸钠）Au,可制备各种设定尺寸的胶体金，颗粒均匀现代免疫化学标记技术，李成文,胶体金的优点,结合原理为物理吸附重金属，图像反差好颗粒均匀，圆球形状，易于辨认做成不同大小的尺寸，可进行双标记可同时用于免疫透镜，免疫扫描电镜,胶体性质,吸附离子而带电吸附大分子物质（物理）胶体沉聚（在胶体金中加入一定量的电解质如NaCl,马上可以看到胶体金的沉聚现象-由红色变成蓝色，放置一段时间或超速离心后在试管底部得到蓝色沉淀）胶体保护（在胶体金中加入一定量的亲水
8、大分子可使溶胶变得稳定，再加NaCl时不再出现沉聚现象）,2 胶体金-抗体复合物制备,抗体蛋白不含或只含极少电解质,IgG(1mg/ml)/四硼酸钠（2mM pH=9）4 C，20h,中间换液34次,?,最适pH：在接近或略高于抗体的等电点时复合物最稳定（高0.10.2 pH）查抗体的等电点 IgG，最适pH=9.09.2 PA,最适pH=5.96.2一般抗体pH在透析时调好 胶体金pH用稀酸碱调（0.1 M HCl,0.2M KCO3）*pH测定：重金属会阻塞电极，用pH纸或先在胶体金中加入23滴1%乙二醇（Mw20,000）后在测,最适蛋白量：,最小蛋白量：找到胶体金颜色（红）刚开始变化（
9、紫）的试管，其前一管为最小蛋白量最适蛋白量：（）最小蛋白量,？,分子量小的抗体应事先与非特异蛋白（如SA）偶联后才能吸附到胶体金表面,IgG-胶体金复合物制备,将IgG溶于双蒸水内，浓度1mg/ml对2mM/四硼酸钠缓冲液（pH=9）透析，4 C，20h,中间换液34次离心，100,000g，4 C，1h，取上清调胶体金pH=9确定IgG与胶体金结合的最适蛋白量按最适蛋白量混合IgG与胶体金，再加10%BSA 1ml,轻轻混匀离心，4 C，45m，离心力大小由胶体金尺寸大小决定（15nm,60,000g，5nm,125,000g弃上清，将沉淀溶于1ml 20mM Tris缓冲液中（pH=8.2
10、，内含1%BSA）,4 免疫电镜实验设计,包埋前法：先免疫标记，后制备超薄切片（适用于抗原暴露在外的情况，如膜外周蛋白）,超薄切片可按常规电镜标本制备技术进行包埋后法：先制备超薄切片，后免疫标记（适用于细胞内抗原)，超薄切片技术需按免疫电镜标本制备技术进行,亲和标记：抗原抗体 激素受体 糖基植物凝集素免疫标记：一抗标记法，二抗标记法，PA法，PG法，其它分子桥技术（如生物素与 抗生素蛋白）,包埋后法的免疫标记程序,0.02M 甘氨酸（in 0.1M PB），10m(3*3)0.1M PB(含1%BSA),RT 5m一抗 in 0.1M PB(含1%BSA),RT,1-2h或4 C过夜漂洗，0.1M PB，10m(3*3)二抗-胶体金，RT,1-2h漂洗，0.1M PB，10m(3*3)漂洗，dd H2O，10m(3*3)染色漂洗，dd H2O，10m(3*3)干燥待镜,*标记过程中，任何一步都不能让载网干*对照实验,电镜细胞化学,是利用特异的化学或生化反应在电镜下对细胞化学成分进行定性与定位分析（*主要是蛋白质尤其是酶）,结构保存与酶活性保存问题选择适合的化学或生化反应,电镜放射自显影,
