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1、细胞免疫荧光技术,实验目的,掌握免疫荧光技术的基本原理熟悉细胞免疫荧光技术的方法了解在免疫细胞化学技术中如何获得好的实验结果,实验原理,原位检测抗原抗体特异反应间接法,间接荧光抗体染色法示意图,Hela细胞,Vinculin,实验用品,试剂:固定液:4%PFA细胞通透:0、2%TritonX封闭试剂:10%正常山羊血清一抗:小鼠源抗Vinculin单克隆抗体二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠IgGDAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)PBS洗涤缓冲液:PH7、4,材料:Hela细胞细胞培养皿仪器:荧光显微镜,实验步骤,一,细胞制备与细胞固定,实验步骤,二,细胞免疫荧光ICC染
2、色,0、2%TritonX处理5min,封闭室温30min,4过夜,371-2小时,375-10min,荧光显微镜观察,实验结果,三,观察,human HeLa cells,实验中应注意的问题,细胞不要铺的过密:60-70%防止细胞污染 固定时间不要太长,一般10-30min TrionX处理时间不宜过长,膜蛋白可不必处理 选择合适的封闭液 二抗孵育后,一定要洗干净 必要时用恒温摇床摇洗,1、免疫荧光技术 2、免疫酶技术 3、免疫亲与技术 4、胶体金技术,标记物 使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质,免疫细胞化学技术,免疫细胞化学技术注意事项,选择合适的方法 材料要留好 选择抗体 选择标记酶 封闭液的选择 设定对比实验,考虑题,检测Hela细胞中蛋白A定位情况,考虑应选择什么方法,用什么仪器观察？,疑难解答,一,缺乏染色,二,高背景,三,细胞/组织的形态被破坏,四,染色不正确,感谢您的聆听！,
