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1、蛋白质化学,蛋白质的概念 蛋白质(Protein)是由许多不同的氨基酸，按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子。,二、蛋白质的生物学意义,蛋白质是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，是生命活动的主要体现者。,结构骨架催化作用运输作用,免疫作用运动作用调节作用,三、蛋白质的化学组成,(一)蛋白质的元素组成基本元素：C H O N S 5055%68%2023%1518%04%其他元素（某些蛋白质）：P Fe Cu Zn Mo I Se,蛋白质的含氮量,大多数蛋白质的含氮量接近于16%蛋白质氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分所以，可以根据生
2、物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量.蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数 6.25,(二）蛋白质的分子组成,(三)蛋白质的其他组分,蛋白质 简单蛋白质 结合蛋白质 氨基酸部分 非氨基酸部分 糖 脂 核酸 辅因子,三、蛋白质的基本单位-氨基酸,（一)氨基酸的结构特点 除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。,手性-碳原子,天然氨基酸除脯氨酸和甘氨酸外，其余均属于L-氨基酸。除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性和立体异构。各种氨基酸的区别在于侧链R基团（Radical)不同。,八种必需氨基酸：Thr,Lys,Val,LeuIle,Met,Tyr，Phe,苏赖缬
3、亮异亮，甲硫酪苯丙。,(二）氨基酸的分类,1.常见的天然氨基酸：极性氨基酸按极性分 非极性氨基酸 酸性氨基酸 按酸碱性分 碱性氨基酸 中性氨基酸,按营养状况分 必需氨基酸 非必需氨基酸2.稀有氨基酸 是正常氨基酸的衍生物在遗传上没有直接的三联密码.(3)非蛋白质氨基酸 不在蛋白质分子中出现的氨基酸大多是-氨基酸的衍生物也有D-型和-、-、-氨基酸.,（三）氨基酸的理化性质：,1.一般物理性质：无色晶体，熔点极高，一般在2000 以上。不同氨基酸有不同的味感。能溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂。,2.两性解离及等电点：,氨基酸分子是一种两性电解质。通过改变溶液的pH可使氨基酸分子的解离状态发生改变
4、。,Pk2是AA的-NH3+被滴定一半时的pH（NH3+释放H+）,Pk1是AA的-coo-被滴定一半时的pH（coo-结合H+）,氨基酸的解离曲线,等电点的概念:氨基酸分子上的-NH3+和-COO-解离度完全相同；氨基酸所带的净电荷为零；些时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。等电点（pI）时溶解度最小。,等电点的推导,移项：,根据等电点的定义:,Ala+=Ala-,整理：K1 K2 Ala=Ala H+H+,K1 K2=H+2,两端取对数：-lg H+2=-lg K1-lg K2,-lg K1=pk1-lg K2=pk2,2（-lg H+）=pk1+pk2,根据pH 的定义得：pH=lg 1
5、/H+=-lg H+,2 pH=pk1+pk2,pI=1/2(pk1+pk2),中性氨基酸：pI=(pK1+pK2)/2 酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COO-)/2 碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2 pK 1指-羧基离解常数的负对数值；pK 2指-氨基离解常数的负对数值pK R指侧链R基离解常数的负对数值。,3.紫外吸收性质：,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。可采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量。,氨基酸的紫外吸收光谱,4.氨基酸的化学反应,（1）茚三酮反应 AA+水合茚三酮 蓝紫色化合物（2）甲醛反应 AA+甲醛
6、二羟甲基氨基酸（3）亚硝酸反应 AA+亚硝酸-羟氨基酸+氮气+水,加热,pH8.3,无水HF,AA与茚三酮反应,四、肽(peptide),（一）肽的概念,肽:若干氨基酸通过肽键聚合而成的链状化合物。肽键:肽分子中，一个氨基酸分子的-羧基与另一个氨基酸分子的-氨基经脱水形成的酰胺键（-CO-NH）。二肽.三肽:根据成肽的氨基酸数目命名.寡肽：10肽以下称之。多肽：10肽以上称之。氨基酸残基：氨基酸成肽后已不完整，故称之。肽单位：与肽键相连的六个原子（C1,C,O,N,H,C 2)组成的肽平面。,氨基酸残基与肽单位,氨基酸的顺序：指从“N”端“C”端氨基酸的排列顺序。肽的表示法:按氨基酸的顺序依次
7、读为某氨酰某氨酰某氨酸。如：谷氨酰半胱氨酰甘氨酸.简称：谷胱甘肽简式：GluCysGly,（二）肽结构的表示,（三）生物活性肽：,生物体内具有特殊的生物学活性的肽类物质。重要的有谷胱甘肽、神经肽、肽类激素等。,1.谷胱甘肽（GSH）：,全称为-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。,谷胱甘肽的生理功用：参与氧化还原反应解毒作用保护巯基酶的活性,-,谷胱甘肽（GSH）,2.多肽类激素：,种类较多，生理功能各异。主要见于下丘脑及垂体分泌的激素。,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-,3、神经肽,脑啡肽,Leo脑啡肽,有镇痛麻醉作用。
8、,五、蛋白质的结构,（一）蛋白质的一级结构,1、蛋白质的一级结构的概念一级结构指多肽链的氨基酸组成、线性顺序、多肽链数目和关联。多肽链的氨基酸顺序，是蛋白质生物功能的基础。稳定一级结构的力：肽键、二硫键。,胰岛素（Insulin）：,2、蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,3.一级结构测定的意义：,一级结构是研究高级结构的基础。可以从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系。可以为生物进化理论提供依据。可以为人工合成蛋白质提供参考顺序。,细胞色素c的一级结构与生物
9、进化的关系,1.样品纯化（纯度97%以上）；2.测定蛋白质的分子量；3.末端分析 N端分析：PITC法 DNFB法 Edman法 DNS-CL法C端分析：肼解法,羧肽酶法 4.拆分多肽链:可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理5.用两种以上方法特异性裂解：肽链内切酶（胰蛋白酶）化学试剂（溴化氰）6.分离纯化肽段：双向电泳7.测定氨基酸组成：氨 基酸自动分析仪(峰图）8.跨切口重迭肽段，分析氨基酸顺序,3一级结构测定的程序,PITC法测定N-端氨基酸残基,DNFB法分析N-端氨基酸残基,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。,羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所
10、有C-末端氨基酸残基；,根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。,羧肽酶法分析C-端氨基酸残基,羧肽酶B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,蛋白质的特异裂解,胰蛋白酶（trypsin)的裂解作用,BrCN的裂解作用,氨基酸自动测序仪,确定肽段在多肽链中的次序,（二）蛋白质的空间结构,蛋白质空间结构（构象）：指蛋白质分子中原子和基团在空间的排列分布和肽链的走向。,1.概述,何谓构象：构象是指一个由几个碳原子组成的分子，由于单键的旋转造成的不同碳原子上各原子或取代基团的空间排布。构象的改变不需要共价键的断裂和重组，只需要单键旋转方向和角度
11、改变即可。,conformation,configuration,乙烷的构象,决定蛋白质空间构象的因素 蛋白质的氨基酸序列肽键的刚性平面性质由于C=O双键中的电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。与肽键相连的六个原子构成刚性平面结构，称为肽单元或肽键平面。但由于-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以-碳原子作相对旋转，旋转的相对角度称C原子的两面角和，可描述多肽的所有可能构象。,R基团的性质和排布：空间位阻基团相互作用氢键离子键疏水键范德华力共价键（二硫键、酯键）,稳定蛋白质构象的力,2.蛋白质二级结构,蛋白质的二级结构：指
12、一级结构进一步盘绕折叠，其主链形成的局部构象。二级结构的类型：主要有-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲。维持二级结构的力：主要是氢键。,左手/右手-螺旋,角蛋白分子中的二硫键,影响-螺旋稳定的因素,极大的侧链基团（存在空间位阻）；连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应)有脯氨酸、羟脯氨酸的存在（不能形成氢键）。,-折迭包括平行式和反平行式两种类型,（4）无规卷曲的特征 coil,无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象。,RNase的分子结构,-螺旋,-折迭,-转角,无规卷曲,超二级结构(模序）motif,在蛋白质分子中，若干具有二级结构的肽段在空间上相互接近.形成有
13、规则的，空间上能够辩认的二级结构组合体。模序是蛋白质发挥特定功能的基础。如,等。,锌指结构：螺旋-折迭-折迭模序,转录因子MyoD的螺旋-环-螺旋模序,结构域 与分子整体以共价键相连，这是它与亚基的区别。,结构域domain,多肽链在超二级结构基础上进一步盘曲折叠为紧密的近似球状的结构。,在空间上彼此分隔，各自具有部分生物学功能的结构。,图示：假设具有2个结构域的蛋白质的线性折叠途径,蛋白质的三级结构：是指蛋白质分子在二级结构基础上进一步盘曲折叠而形成的整体构象，也就是一条多肽链全部原子在三维空间的排布位置。,4、蛋白质的三级结构,维系三级结构的力：主要是非共价键（次级键），如疏水键、氢键、盐
14、键、范氏引力等，但也有共价键，如二硫键等。,疏水作用是维持蛋白质结构最主要的稳定力。疏水基团因疏水作用而聚向分子内部，亲水基团多分布在分子表面。因此，具有三级结构的蛋白质都是亲水的。,肌红蛋白的三级结构,溶菌酶分子的三级结构,胰岛素分子的三级结构,4.蛋白质的四级结构,蛋白质的四级结构：由两条或两条以上具有三级结构的多肽链相互缔结在一起的聚合体。其中每条具有三级结构的多肽链为一个亚基sub-unit。维系蛋白质四级结构的力是次级键。由多个亚基聚集而成的蛋白质称为寡聚蛋白。,血红蛋白(hemoglobin)的四级结构,血红蛋白的四级结构,亚基的立体排布,六、蛋白质分子结构与功能的关系,（一）蛋白
15、质一级结构与功能的关系 1、一级结构与生物进化 2、一级结构与分子病（二）蛋白质高级结构与功能的关系 1、蛋白质变构与功能的关系 2、蛋白质变性与功能的关系,七 蛋白质的性质,(一)胶体性质 分子量很大 很大的吸附力不能透过半透膜 其水溶液是亲水胶体,蛋白质分子量的测定：超离心沉降法凝胶电泳法凝胶过滤法渗透压法,超离心沉降法：把蛋白质溶液放在25-50万倍重力场的离心作用下，使蛋白质颗粒从溶液中沉降下来。应用光学方法观察蛋白质的沉降行为，从而判断出蛋白质的沉降速率，计算出蛋白质的分子 量。一般把单位（厘米）离心场中的沉降速率，称为沉降系数，用S表示。一个S单位等于110-13秒。蛋白质的分子量
16、可以直接用S表示。,（二）蛋白质的两性解离与等电点,由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的氨基和游离的羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质，因而也具有特定的等电点。,在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。当溶液pH=等电点时，蛋白质粒子净电荷为零，在电场中不移动；当溶液pH等电点时，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；当溶液pH等电点时，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。,（三）蛋白质的变性与复性,1、蛋白质的变性：在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，称为蛋白质的变性(dena
17、turation)。,（1）变性蛋白质的特征：,物理性质：旋光性改变溶解度下降沉降率升高光吸收度增加,化学性质：官能团反应性增加易被蛋白酶水解 生物学性质：原有生物学活性丧失抗原性改变,（2）引起蛋白质变性的因素,物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等.化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、去污剂、尿素,2.蛋白质变性的复性,复性的概念：变性蛋白在一定的条件下，恢复其原有的的空间结构与生物活性的过程称之。影 响复性的因素：变性的原因蛋白质的种类变性的程度,沉淀：蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。,变性的蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性。,凝固：加热使蛋白质变
18、性并凝聚成块状称为凝固。,核糖核酸酶的变性与复性,八 蛋白质的分类,（一）按分子形状分球状蛋白质:纤维状蛋白质:-角蛋白 毛发、指甲等-角蛋白 蚕丝、蜘蛛丝等 胶原蛋白 皮肤、软骨等,（二）按化学组成和溶解度分简单蛋白质结合蛋白质(三)按生物功能分结构蛋白 收缩蛋白 运输蛋白 贮藏蛋白 免疫蛋白 调节蛋白 酶,九 蛋白质的分离纯化,（二）分离纯化的方法和原理 1.根据分子大小进行分离透析和超滤 离心沉降凝胶过滤（凝胶层析）,2.根据溶解度差异分离等电点沉淀 盐析 低温有机溶剂沉淀3.根据电离性质不同分离电泳 离子交换层析4.根据分子与配基的亲和性质分离亲和层析,1、盐析与有机溶剂沉淀：盐析：概
19、念：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。,蛋白质分离纯化方法简介,盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。,凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。沉淀原理是：A、脱水作用；B、使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。,有机溶剂沉淀蛋白质,蛋白质的透析,2、电泳,带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离.主要方法有聚丙烯酰胺电泳，等电聚焦，毛细管电泳等。,垂直板电泳,3、层析,层析：是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离的方法。主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等。,凝胶过滤分离蛋白质,亲和层析,4、超速离心,超速离心：利用物质分子量、密度、形状的不同，经超速离心后分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。,
