第四章非细胞型微生物的课件.ppt

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1、2023/3/18,1,第四章 非细胞型微生物的形态 和分类,第四章 非细胞型微生物的形态、结构与分类,2023/3/18,2,主要内容：病毒的概念、特征、分布病毒粒子的形态结构和化学组成噬菌体概念、结构、化学组成复制方式温和噬菌体和溶源性细菌类病毒、拟病毒和朊病毒病毒的抗性,2023/3/18,3,一、病毒的概念、特征 1.概念 病毒（或病毒粒子）是由RNA或DNA分子组成的传染因子，是非细胞生命体。通常由一种或几种蛋白质构成的衣壳包裹，有些病毒还覆盖有更为复杂的包（囊）膜。1898年，俄.伊万诺夫斯基烟草花叶汁液通过细菌过滤器后仍然能感染。荷兰的benjerinck 发明了“virus”一

2、词，意思为拉丁文的“毒”。被称为“滤过性病毒”1935年Stanley提取到TMV（tobacco mosaic virus）烟草花叶病病毒结晶并因此获诺贝尔奖。1953年Bauden提出定义：“小于200nm的专性寄生物叫病毒”。但后来发现粘液瘤病毒为250*290nm。1968年哈本：病毒是超显微的、没有细胞结构的、专性活细胞内寄生的大分子微生物，它们在活体外具有一般大分子的特征，一旦进入宿主细胞又具有生命特征。,2023/3/18,4,2.病毒的特征 形态极其微小，形态多样。必须在电镜下才能观察，一般都 具过滤性；个体 9nm250*250nm。如菜豆畸矮病毒9nm，脊髓灰质炎病毒12n

3、m，痘病毒250*250nm。只有在放大几万十几万倍的电子显微镜下才能可见超显微。没有细胞构造,故也称分子生物;仅由蛋白质和单一核酸构成的大分子，无完整酶系。既无产能酶系，也无蛋白合成系统；以核酸复制的方式进行繁殖。专性细胞内寄生，体外无生命特征，不存在个体生长和二均分裂等细胞繁殖方式；在离体条件下,能以无生命的化学大分子状态存在,并可行成结晶；对一般抗生素不敏感，但对于干扰素敏感。,2023/3/18,5,3.分布 几乎所有物种有感染。动物病毒约700种；植物病毒约300种；细菌病毒最多，仅硫细菌、铁细菌、硝化细菌中未见报道。,2023/3/18,6,二、病毒的形态构造和化学组分 病毒粒子v

4、iron：成熟的具有侵染力的病毒颗粒。1.形态（三类典型形态）：球状（动物、真菌等病毒）廿面体对称的结构 杆状（植物病毒）螺旋对称的结构 蝌蚪状或丝状（噬菌体）复合对称的结构,2023/3/18,7,病 毒 大 小及形状,1微米,2023/3/18,8,病毒的基本结构：,2.病毒构造,典型病毒粒子的构造,2023/3/18,9,病毒构造典型病毒粒子的构造：病毒粒子的对称体质（指衣壳粒的排列有三种）病毒群体形态：包涵体(inclusion body)，噬菌斑(plaque)，空斑(plaque)，枯斑(lesion),“非典型肺炎”元凶冠状病毒SARS,冠状病毒是过去较常见的病毒，可引起普通感冒

5、，致死率远低于1%。但此变异的病毒致死率3.5-4%。,2023/3/18,10,2023/3/18,11,包涵体（inclusion body）寄主细胞经病毒感染后形成的光镜下可见的蛋白质晶体，内含1-几个病毒粒子。按形态分为颗粒体和多角体；按寄生部位可分为核型和质型。是病毒的聚集体;是病毒的合成部位;是病毒蛋白和与病毒感染有关的蛋白质;非病毒性包涵体，由化学因子或细菌感染形成.,2023/3/18,12,下层培养基,双层培养基,敏感菌+上层培养基,噬菌体稀释液,培养,噬菌斑,噬菌斑,敏感菌菌苔,噬菌斑(plaque),2023/3/18,13,空斑和病斑,人工培养的单层动物细胞感染病毒后,

6、也会形成类似噬菌斑的动物病毒群体,称为空斑在植物细胞培养物上的与噬菌斑类似的空斑,称为病斑.因为受肿瘤病毒感染.,2023/3/18,14,三类典型形态的病毒,二十面体对称的代表-腺病毒,复合对称的代表-T偶数噬菌体,螺旋对称的代表-烟草花叶病毒(TMV),2023/3/18,15,螺旋对称的代表-烟草花叶病毒(tobao mosaicvirus,TMV),螺旋对称的代表-烟草花叶病毒(tobacco mosaicvirus,TMV),2023/3/18,16,二十面体对称的代表-腺病毒(Adenovirus),2023/3/18,17,刺突tail pins,Phaga,bacteriooh

7、aga,95nm,95nm,head,neck,tail（24环）,尾丝(tail fibers),65nm,复合对称的代表-T偶数噬菌体,2023/3/18,18,3.化学组成 病毒蛋白质：一种或几种。占30%(T4)70%（狂犬），位于外层。功能：构成病毒外壳，保护病毒核酸免受核酸酶及其他理化因子的破坏；决定病毒感染的特异性，与易感细胞表面存在的受体具特异亲合力,促使病毒粒子的吸附；决定病毒的抗原性,并能刺激机体产生相应的抗体；病毒蛋白还构成了病毒组成的酶（溶菌酶、DNA聚合酶、反转录酶等）.,2023/3/18,19,病毒核酸:仅有一类，DNA或RNA(噬菌体多)。双链或单链，链状或环状

8、，正链或负链。其他：脂类、糖等,（二）特殊结构及其功能,(1)病毒包膜 一些复杂的病毒的核壳外还覆盖着一层称做包膜的脂蛋白膜。包膜是病毒以出芽（budding）方式成熟时，由细胞膜衍生而来的，是包裹在病毒核衣壳外面的一层较为疏松、肥厚的膜状结构。病毒包膜的基本结构与生物膜相似，是脂双层膜（脂类和糖蛋白）。病毒包膜有维系毒粒结构，保护病毒核壳的作用。特别是病毒的包膜糖蛋白，具有多种生物学活性，是启动病毒感染所必需的。,病毒的特殊结构包膜（模式图）,脂类的来源与作用 病毒包膜的脂类来源于细胞，其种类和含量均具有对寄主细胞的特异性。脂类具有对寄主细胞的亲嗜性，可决定病毒特定的侵害部位。,糖蛋白的来源

9、与作用 蛋白质由病毒基因组编码而合成，而糖则获自寄主细胞。病毒糖蛋白是由一条或几条多肽链骨架与寡糖侧链连接形成，位于包膜表面形成包膜突起(peplomere)或刺突(spike)。作用：赋予病毒的某些特殊功能 辅助病毒的感染作用 启动病毒感染所必需的 包膜糖蛋白是由多肽链骨架与寡糖侧链，通过-N-糖苷键将糖链的N-乙酰葡萄糖胺与肽链的天冬酰胺残基连结形成。根据寡糖链中单糖残基组成的区别，包膜糖蛋白又分为简单型糖糖蛋白和复合型糖蛋白两类。,(2)病毒基质蛋白或被膜,定义：某些病毒(如正黏病毒和副黏病毒)在核衣壳的外层和包膜内侧垫有一层蛋白，称为基质蛋白。功能：它具有支撑包膜，维持病毒结构的功能。

10、更重要的是它促进核衣壳与包膜之间的识别，有利于病毒的装配。疱疹病毒的被膜含有病毒蛋白和酶，有助于起始病毒的复制。,(3)病毒触须,定义：触须是有些无包膜病毒核衣壳上的突出物。功能：与包膜刺突相似，具有凝集某些动物红细胞和毒害敏感寄主细胞的作用。,2023/3/18,26,三、病毒及其繁殖方式（一）分类：病毒种类很多，根据病毒寄生的对象来分，有 植物病毒、动物病毒和微生物病毒（原核生物病 毒（噬菌体）、藻类病毒（噬藻类体）、真菌病毒（噬真菌体）（二）繁殖方式及特点 1.原核生物病毒-噬菌体 一般把侵染细菌、放线菌的病毒叫噬菌体，侵染真菌的病毒叫噬真菌体。,2023/3/18,27,噬菌体(bac

11、teriophage,phage),噬菌体并没有个体的生长过程，而只有其基本成分的合成和装配，即首先将各个部件合成出来，然后装配，所以一般将噬菌体的繁殖称做复制。根据噬菌体与宿主的关系：烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解 的噬菌体.温和噬菌体（或溶源性噬菌体）：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并 且可以随 宿主DNA的复制而进行同步复制，在 一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。,2023/3/18,28,繁殖过程一般分为五个阶段：即吸附、侵入、复制、装配和释放。,烈性噬菌体,2023/3/18,29,吸附：噬菌体和宿主细胞上的特异性吸附部位进行特异性

12、结合，噬菌体以尾丝牢固吸附在受体上后，靠刺突“钉”在细胞表面上。侵入：核酸注入细胞的过程。噬菌体尾部所含酶类物质可使细胞壁产生一些小孔，然后尾鞘收缩，尾髓刺入细胞壁，并将核酸注入细胞内，蛋白质外壳留在细胞外。复制：包括核酸的复制和蛋白质合成。噬菌体核酸进入宿主细胞后，会控制宿主细胞的合成系统，然后以噬菌体核酸中的指令合成噬菌体所需的核酸和蛋白质。装配：DNA分子的缩合-通过衣壳包裹DNA而形成头部-尾丝及尾部的其它部件独立装配完成-头部与尾部相结合-最后装上尾丝，至此，一个个成熟的形状、大小相同的噬菌体装配完成。释放：裂解：多以裂解细胞的方式释放。分泌：噬菌体穿出细胞，细胞并不裂解。通常情况下

13、，一个噬菌体通过上述五个过程能合成100-300个噬菌体。烈性噬菌体的这种生长繁殖方式也称为一步生长，,2023/3/18,30,吸附(adsorption),影响因素：噬菌体数量；阳离子；辅助因子；温度。,敏感细菌细胞表面的特定部位（受体）,吸附的机理：尾丝尖端与受体发生共价结合。,2023/3/18,31,侵入(penetration)：DNA进入,收缩的尾鞘（12环）,2023/3/18,32,上图：病毒核酸链接 入寄主核酸链右图：病毒核酸复制,复制（replication）：借助于细菌的合成机构,2023/3/18,33,装配(fabrication)：装配成完整的大肠杆菌噬菌体,20

14、23/3/18,34,释放(set free)寄主死亡并破裂，释放出里面的病毒，新一代病毒开始新的生命旅程.,2023/3/18,35,大肠杆菌T系列噬菌体的繁殖过程,2 病毒的增殖,1)、一步生长曲线 一步生长曲线是研究病毒复制的一个经典试验，最初是为研究噬菌体的复制而建立，以后推广到动物病毒和植物病毒的复制研究中。基本方法是以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附(attachment)后，或高倍稀释病毒细胞培养物，或以抗病毒抗血清处理病毒-细胞培养物，以建立同步感染，然后继续培养并定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征

15、性的繁殖曲线，即一步生长曲线 从一步生长曲线中，可以获得病毒繁殖的两个特征性数据：潜伏期（latent period）和裂解量（burst s ize）。,（1）潜伏期和裂解量,潜伏期是毒粒吸附于细胞到受染细胞释放出子代毒粒所需的最短时间。不同病毒的潜伏期长短不同，噬菌体以分钟计，动物病毒和植物病毒以小时或天计。裂解量是每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目。其值等于潜伏期受染细胞的数目除以稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。,（2）隐蔽期（eclipse period）,隐蔽期是指自病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间。隐蔽期

16、发生在病毒感染的早期，即在潜伏期的前一段，包括病毒的吸附、穿入、脱壳和生物合成。受染细胞内检测不到感染性病毒,（3）裂解期（burst period）,裂解期又称成熟期，是指发生在潜伏期之后的寄主细胞迅速裂解死亡，噬菌体粒子急剧增加的一段时间。此期发生在病毒感染的后期，包括病毒的装配和释放。,（4）稳定期（stable period）,稳定期发生在裂解期末，是指感染后的寄主细胞全部被裂解，子代毒粒数目在最高处达到稳定的时期。,2023/3/18,42,噬菌体效价的测定效价指噬菌体悬液的浓度。即噬菌体数/ml样品。,液体稀释管法,双层平板法,单层平板法,快速玻片法,斑点试验法,斑点试验法,202

17、3/3/18,44,2023/3/18,45,双层平板法,菌液+噬菌体试样+琼脂培养基,噬菌斑数=试样中噬菌体数,2023/3/18,46,2023/3/18,47,温和噬菌体与溶源性细菌,温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主 DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。原噬菌体（或前噬菌体）：即整合在宿主核DNA 上的噬菌体的核酸。溶原性细菌：指在核染色体上整合有原噬菌体的细 菌。可进行正常生长繁殖，而不被裂解。溶源性(Lysogeny):溶源菌所特有的性质。温和噬菌体侵入相应宿主细胞后，由于前者的基因组整合到后者的基

18、因组上，并随后者的复制而进行同步复制，因此，这种温和噬菌体的侵入并不引起宿主细胞裂解，此即称溶源性。,2023/3/18,48,具有同步复制能力；,温和噬菌体特点,游离态 温和噬菌体存在形式 整合态 营养态,具有整合能力；,都是dsDNA;,温和噬菌体,2023/3/18,49,溶源菌,细菌的溶源性具有遗传性,溶源菌对同源噬菌体具有免疫性,溶源性细菌在培养中不易被查觉,非溶源细胞,自发裂解和诱导裂解：有少数噬菌体可自发或诱发裂解宿主细胞变成烈性噬菌体,溶源性细胞可获得一些新的生理特性,复愈:溶源菌,白喉毒素,白喉杆菌,2023/3/18,50,四、亚病毒（仅含核酸或蛋白质的病毒）,类病毒(Vi

19、roid)：一类寄生于高等生物细胞中最小的病原体，与病毒类似，没有蛋白质，只含有具有单独侵染性的较小型的核糖核酸（RNA）分子。,拟病毒(Virusoid)：又称类类病毒、壳内类病毒、卫星病毒等，是一类包裹在病毒体中的有缺陷的类病毒或只含有不具备侵染性的RNA。,朊病毒(Prion)：也称为普立昂没有核酸而有感染性的蛋白质颗粒。,2023/3/18,51,类病毒(Viroid),马铃薯纺锤块茎病的病原体,长50nm棒状RNA分子,179核苷酸半体180核苷酸半体,RNA由,组成,两半体间有7成碱基以氢键方式结合共形成122个碱基对,Virus and Viroid Diseases of Po

20、tato,特点：单链RNA，359bp，mw75000-130000D，只能编码50-75个氨基酸，不足以编码一个蛋白质，侵染117种茄科植物。是迄今发现的最小的生物体，比最小的病毒小十倍。,2023/3/18,52,拟病毒(virusoids),是包裹在植物病毒粒子中的类病毒,探索核酸的结构与功能,探索RNA-2和RNA-1间的关系,组建弱毒疫苗,探索病毒本质和生命起源,又称类类病毒，特点：与植物病毒核酸同时存在时才能感染，不能单独感染,2023/3/18,53,朊病毒(prion,virino),疯牛病(海绵状脑病),一种感 染性蛋白粒子致病因子称朊病毒,PrPc已被克隆,空间结构由a_螺

21、旋构成,朊病毒可由a_螺旋(PrPc)变成b_折叠(PrPsc),PrPsc为致病型蛋白粒子,PrPsc在神经细胞内沉积,由羊瘙痒病中获得，仅含蛋白质而不含核酸。分正常和不正常一些因子诱发正常的prion构象发生改变，由-螺旋为主变成-折叠为主。,2023/3/18,54,PrPsc,克病最初病例养殖场主,克病潜伏期可达数十年,克病可通过血液传染,PrPc,朊病毒的三维结构,朊病毒(prion,virino),PrPc,五 病毒的抵抗力与变异,（一）物理因素(1)温度 多数病毒耐冷不耐热，离开机体后在室温中只能存活数小时，4几天就被灭活。某些病毒，如肝炎病毒和肠道病毒，抵抗力较强，能在自然界中

22、存活数日至数月。大多数病毒经加热60，30min即可被灭活。但乙肝病毒需加热100，10min才能被灭活。病毒在低温下活性不易丧失。低温是保存病毒活力的有效方法，在-20-70可保存几个月；在-196(液氮)中则能存活几年。经冷冻干燥处理的病毒在4下可永久保存。有包膜的病毒一般比无包膜的病毒对温度敏感，反复冻融易被灭活。许多病毒在有蛋白质和盐存在的条件下较稳定。因此，在研制活疫苗时添加盐类有利于疫苗的保存。,(2)射线 病毒对射线、X射线和紫外线敏感，易变性、钝化，受直射日光和紫外线照射后即失去传染性，但其照射剂量要比细菌大。射线能灭活病毒是因为其光量子可击毁病毒核酸的分子结构，使其失去生物活

23、性。辐射钝化单链核酸的作用较强，能导致多核苷酸链的致死性断裂，而对双链核酸仅有一条链断裂。紫外线对DNA的作用是导致多核苷酸链上邻近的嘧啶形成二聚体。有些病毒(如脊髓灰质炎病毒)经紫外线灭活后，再遇到可见光照射后，激活修复酶可使灭活的病毒复活，称此现象为光复活作用(photoreactivation)。,(3)干燥,在常温下，干燥易使病毒灭活，但若冷冻后进行真空干燥，可使病毒长久存活(数年至数十年)，故常用此法保存病毒毒种。,（二）化学因素,(1)pH和离子环境 病毒一般在pH 5.09.0的环境和生理浓度的盐溶液中稳定，镁离子盐类(如MgCl2，MgSO4等)或Na2SO4可保持病毒的活力，

24、有些活病毒疫苗制剂中常加这类稳定剂。保存病毒以中性或偏碱条件较好。多数病毒在50%中性甘油盐水中能长久存活，常用于制备牛痘苗或保存含病毒的组织块。实验室常用酸性或碱性消毒剂(35石炭酸溶液)消毒被病毒污染的器材和用具。,(2)脂溶剂 有包膜病毒含有脂类，易被乙醚、氯仿、去氧胆酸钠等脂溶剂溶解而使病毒灭活，失去感染性。故包膜病毒对乙醚等脂溶剂敏感，而裸露病毒对乙醚等脂溶剂有较强的抗性。可用乙醚来鉴别病毒是否具有包膜。,(3)染料 某些病毒经活体染料(如中性红、甲苯胺蓝和吖啶橙等)着染后，染料可以穿透病毒，与核酸结合，当病毒遇到可见光时易被灭活，这种现象称光感作用(photosensitizati

25、on)。如病毒空斑实验中用中性红染色，需避光，否则病毒可被灭活而不能形成空斑。,(4)化学消毒剂 多数病毒在0.5%1.0%苯酚溶液中不被灭活，但易被乙醇、甲醛、升汞、氧化剂(如过氧化氢、高锰酸钾、漂白粉、过氧乙酸)、碘酒、强酸及强碱等灭活。饮水中的漂白粉浓度虽能杀死一般细菌，却不能杀灭少数抵抗力较强的病毒(如乙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒及其它肠道病毒)。甲醛可作用于病毒核酸，几乎所有病毒都被甲醛灭活，但仍可保持其抗原性，故常用于疫苗生产。常用甲醛消毒污染了病毒的用具和空气。,(5)特殊杀病毒剂 常用的有-丙内酯和环氧乙烷。前者是强力的烷化剂和酰化剂，0.2%0.4%即可杀死各种病毒，但其水溶

26、液不稳定，现主要用于杀灭储存的人血清或血浆中的肝炎病毒。环氧乙烷适用于对书籍、纸张、皮革、织物、工艺品和仪器等的消毒，但因易爆炸和燃烧，须储于特殊容器中谨慎使用。此外还有-丙二醇、三乙基乙二醇和次氯酸钠等都能杀灭病毒。,2023/3/18,63,六、病毒与实践,发酵周期明显延长,碳源消耗缓慢,发酵液清淡,发酵产物形成缓慢或根本不形成,噬菌体固体培养会发现大量噬菌斑,电镜可看到噬菌体,例罐,噬菌体与实践,后果：减产,主要是引起某些发酵的噬菌体污染例：丙酮、丁醇发酵中的噬菌体污染；抗生素发酵中的噬菌体污染；食品工业上的噬菌体污染。,噬菌体的危害：,污染危害现象：,2023/3/18,64,发酵生产时预防错施,决不使用可疑菌种,严格环境卫生,活菌液严禁排放,通气加料严控,严格执行会客制度,设备灭菌,补救方法：尽快提取产品,加药（金霉素、四环素）抑制,及时更换菌种,使用抗噬菌体菌珠,选育抗性生产菌株,2023/3/18,65,噬菌体的应用：1.作为分子生物学研究的工具 2.用于鉴定未知菌，可到型。3.用于临床治疗传染病 4.检验植物病原菌 5.测定辐射剂量,2023/3/18,66,病毒在基因工程中的应用,动物DNA病毒作为动物基因工程的载体,植物DNA病毒作为植物基因工程的载体,昆虫DNA病毒作为真核生物基因工程的载体,