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1、第八章微生物遗传,遗传型（genotype）：基因型，指生物个体所包含的全部遗传因子，即基因组所携带的遗传信息。表型（phenotype）：表现型，指某一生物所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是遗传型在适合环境条件下通过代谢和发育得到的具体体现。遗传型+环境条件表型（可能性）（现实性）,变异：指生物体在某种外因或（和）内因作用下，所引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。特点：几率低（10-510-10），性状变化大，新性状稳定、可遗传。饰变（modification）：指外表的修饰性改变，是一种不涉及遗传物质结构改变而仅发生在转录、转译水平上的表型变化。特点：群体几乎所有个体发生
2、同样变化，性状变化幅度小，且不稳定、不可遗传。,野生型(wild type)：从自然界中分离到的微生物菌株，称野生型菌株，简称野生型。突变型：野生型菌株经突变后形成的带有新性状的菌株，称突变株，或突变体、突变型。,一、三大经典实验,1.经典转化实验1928 F.Griffith 以 Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）为研究对象。它使人患肺炎，鼠患败血症。S.pneumoniae有两种菌株：S型：有荚膜，菌落表面光滑（Smooth）,有致病性R型：无荚膜，菌落表面粗糙（Rough）,无致病性,什 么 是 遗 传 的 物 质 基 础？,第一节 微生物遗传的物质基础,1）
3、动物试验,2）细菌培养试验3）S型菌的无细胞抽提液试验活R菌+S型菌的无细胞抽提液 大量R菌和少量S菌 说明在死的S型细菌体内可能存在某种具有遗传转化能力的物质，可以进入R型菌细胞，使R性菌株获得表达S型荚膜性状的遗传物质。,培养皿培养,1944年，O.T.Avery等从热死S型菌株提纯了几种可能的转化因子进行体外转化。,第一证据确定DNA是遗传的物质基础,噬菌体感染实验 1952年，A.D.Hershey&M.Chase 利用噬菌体感染实验证明DNA是噬菌体的遗传物质基础。,3.植物病毒重建实验 1956年，H.Fraenkel-Conrat 用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）与霍氏车前花叶
4、病毒(HMV)进行著名的植物病毒重建实验，证明RNA是病毒的遗传物质。,三大经典实验证明核酸是遗传的物质基础,原始株 拆开 重建 感染 分离纯化,植物病毒的重建实验,二、微生物中遗传物质的存在 部位和方式,（一）7个水平1.细胞水平原核生物大部分的DNA存在于核区（核质体），真核生物的存在细胞核内。不同种微生物的细胞核或核区的数目有所不同。如：Aspergillus niger(黑曲霉）单核 杆菌细胞 两核区 A.oryzae(米曲霉）双核 球菌细胞 一个核区同种微生物不同细胞中细胞核或核区的数目也有所不同。如：藻状菌类（真菌）和放线菌的菌丝细胞为多核，孢子为单核.,2.细胞核水平 除核基因组
5、外，还有核外染色体真核细胞核外染色体有：细胞质基因：线粒体、叶绿体共生生物：草履虫的卡巴颗粒，属于Caedibacter属的共生细菌2um质粒：存在Saccharomyce cerevisiae(酿酒酵母)细胞核，不与核基因组整合。原核细胞核外染色体统称质粒。如：F因子（F质粒）R因子（R质粒）Ti质粒等,3.染色体水平1）染色体数目：不同微生物染色体数目差别比较大，真核微生物有较多染色体，原核生物每个核区仅一个染色体。2）染色体倍数：单倍体：细胞中只有一套染色体。双倍体：细胞中含有两套功能相同的染色体。自然界的微生物多数是单倍体，少数微生物如S.cerevisiae(酿酒酵母)的营养细胞，两
6、个单倍体性细胞接合成的合子为双倍体。,4.核酸水平核酸种类：大部分微生物的遗传物质是DNA，部分病毒少数噬菌体的遗传物质是RNA核酸结构：大部分微生物的DNA是双链，双链DNA有环状（原核生物和部分病毒）、线状（部分病毒）、超螺旋状（质粒DNA）；少数病毒如E.coli 的X174和fd噬菌体等的DNA为单链。DNA长度：即基因组的大小，用bp(碱基对)、kb、Mb 为单位，不同微生物基因组的大小差别很大，表现出多样性。已经了解30多种微生物基因数据。,5.基因水平基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传单位。众多基因构成染色体。从基因的功能来看，原核生物的基因是通过调控系统来发挥功能。启
7、动基因（启动子）操纵子 操纵基因 基因调控系统 结构基因 调节基因,基因及表达产物的名称表示基因名称3个小些字母斜体表示，如bio若同一基因不同位点则在基因后用正体大写字母或数字表示，如lacZ抗型基因在基因符号右上角写大写的R。如tetR基因表达产物用3个大写字母（或1个大写、2个小些），如LacZ,：,真核微生物的基因与原核微生物的最明显差异：无操纵子，有大量不编码序列和重复序列，转录和转译被分隔，基因被内含子阻隔。,6、密码子水平7、核苷酸水平,（二）、原核生物的质粒,1、定义、构型和用途质粒：是DNA分子，游离原核生物核基因组或染色体以外，具有独立复制能力的小型的遗传因子。有三种构型：
8、CCC型：共价闭合环状的超螺旋dsDNA。OC型：开放环型L型：线型,2.质粒的类型 1）F质粒：F 因子、致育因子、性因子 与育性有关的质粒 是E.coli等细菌决定性别、具有转移能力的质粒。大小100kb，CCC型质粒。F+菌株：携带F质粒的菌株称F+菌株（雄性）。F-菌株：不携带F质粒的菌株称F-菌株（雌性）。,组成：转移起点可转移因子转移区（tra区）,2）R质粒：抗性因子、R因子 与抗性有关的质粒由两部分组成：抗性转移因子（RTF）：主要含调节DNA复制和拷贝数的基因、转移基因，具有转移功能。抗性决定因子：r-决定因子，主要含各种抗性基因如Tetr、Ampr 等基因，有些R质粒使宿主
9、细胞产生抗金属离子抗性。,由两部分组成：抗性转移因子（RTF）抗性决定因子,3）Col质粒：大肠杆菌素质粒 与细菌素的产生有关的质粒大肠杆菌素由E.coli 某些菌株产生的细菌素，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等方式专一杀死或抑制近缘细菌或同种不同菌株的能力，是由Col质粒编码的蛋白质。Col质粒有两类：分子量小（9kb，5 106），无接合作用，松弛型控制，多拷贝。如Col E1。分子量大（94kb，8 107），具通过接合而转移的功能，严紧型控制，1-2拷贝。如Col Ib。,The ColE1 plasmid carries the following genes:cea：the
10、 colicin toxinimm：immunity proteinkil：lysis proteininc：RNA I-incompatibility determinantRNA II：primer for replicationrop：protein that regulates priming and copy numbermob：proteins for mobilization during conjugationcer：maintains plasmid as monomersexc：exclusion protein,4)Ti 质粒：诱癌质粒、冠瘿质粒 与致病性有关的质粒根癌农
11、杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染双子叶植物的根细胞，释放出Ti质粒，通过Ti质粒的T-DNA与植物核基因组整合，合成正常植物没有的冠瘿碱类，在植物上形成 癌细胞。Ti 质粒，环状，200kb，主要分四部分：毒性区（Vir）接合转移区（con）复制启始区T-DNA区,Ri质粒 与再生根形成有关的质粒与Ti 质粒相似，有Ri质粒转化的根部不形成根瘤，仅生出可再生新植株的毛状根。在基因工程中，Ri 质粒作为外源基因的载体。,6）mega质粒：巨大质粒存在根瘤菌属（Rhizobium）中,质粒上有一系列于与共生固氮有关的基因，分子量大（2.0 108）。,7）降解性质粒：
12、代谢性质粒主要存在假单胞菌属（Pseudomonas）细菌内。质粒DNA上含有能降解某些复杂有机物的酶的编码基因，细菌携带该类质粒可将复杂化合物降解简单形式或能源。,8）隐秘质粒（Cryptic plasmid）隐秘质粒：不赋予寄主任何表型效应的质粒。只有通过物理检测才能发现。,第二节 微生物的基因突变,基因突变 简称 突变广义突变：细胞内或病毒颗粒内遗传物质的分子结构或数量突然发生可遗传的变化。包括基因突变和染色体畸变。狭义突变：基因突变（点突变）,野生型(wild type)：从自然界中分离到的微生物菌株，称野生型菌株，简称野生型。突变型：野生型菌株经突变后形成的带有新性状的菌株，称突变株
13、，或突变体、突变型。,一、基因突变,选择性突变株与非选择性突变株：凡是能用选择性培养基或其他选择性培养条件快速选择出来的突变株称选择性突变株，反之称为非选择性突变株,(一)、微生物发生选择性突变的类型：营养缺陷型（auxotroph）如亮氨酸缺陷型菌株表示为Leu-，对应的野生型表示为Leu+抗性突变型（resistant mutant）如抗链霉素菌株表示为strR，对应的敏感型菌株表示为strs。条件致死突变型(conditional lethal mutant),(二)、微生物发生非选择性突变的类型：形态突变型（morphological mutant）抗原突变型（antigenic mu
14、tant）由于基因突变引起的抗原结构发生突变的变异类型，如细胞壁缺陷、荚膜或鞭毛变异。产量突变型（metabolite quantitative mutant）通过基因突变获得在有用代谢产物产量高于原始菌株的突变株的变异类型。产量提高一般逐步积累。,（三）、突变率每一细胞在每一世代中发生某一性状的突变几率，称突变率。突变率也表示每单位群体在在繁殖一代时产生突变株的数目。如：突变率为10-8表示细胞在108次分裂中会发生一次突变，或表示108个细胞的群体分裂为2 108个细胞时可产生一个突变株。,（四）、微生物基因突变的特点自发性：没有人为诱变因素可自发产生稀有性：突变率比较低，范围10-610
15、-9独立性：某基因突变率不受别的基因影响。多基因同时突变几率极低。可诱变性：诱变剂可提高突变率稳定性：突变后新性状是稳定的、可遗传的。规律性：特定性状具有较稳定的突变率的规律。可逆性：野生型 突变型,正向突变,回复突变,不对应性：突变的性状与引起突变的原因（环境）之间无直接的关系。两种观点：抗生素、紫外线或高温诱变产生相对应的突变性状（非自发性）。认为突变是通过生物对某特定环境(例如化学药物、抗生素和高温等)的适应而产生的，这种环境正是突变的诱因，所产生的抗性性状是与该环境因素相对应的，并认为这就是环境因素对生物体的“驯化”、“驯养”、“蒙导”或“定向变异”。抗生素、紫外线或高温淘汰原有非突变
16、个体（自发性）。抗性突变是可以自发产生的，即使诱发产生，其产生的性状与诱变因素间也是不对应的，即最终适应了的化学药物等不良因素并非诱变因素，而仅仅是一种用于筛选的环境而已。有三个经典实验证明自发突变产生突变株。,微生物突变的自发性和不对应性证明,取敏感于噬菌体的E.coli指数期的肉汤培养物，用新鲜培养稀释成浓度为103/mL的细菌悬液，然后在甲、乙两试管各装10mL。,接着把甲管中的菌液先分装在50支小试管中(每管0.2 mL)，保温24-36h。,微生物突变的自发性和不对应性证明,把各小管的菌液分别倒在50个预先涂满噬菌体T1的平板上，经培养后分别计算各皿上所产生的抗噬菌体的菌落数。,微生
17、物突变的自发性和不对应性证明,乙管中的10mL菌不经分装先整管保温2436 h，然后分成50份分别倒在同样涂满T1的平板上，经同样培养后，也分别计算各皿上所产生的抗噬菌体菌落数。,微生物突变的自发性和不对应性证明,结果：在来自甲管的50皿中，各皿出现的抗性菌落数相差极大，而来自乙管的则各皿上抗性菌落数基本相同。,微生物突变的自发性和不对应性证明,结论：Ecoli抗噬菌体性状的产生，并非由所抗的环境因素(即噬菌体T1)诱导出来的，而是在它接触T1前，在某次细胞分裂过程中自发产生的。,微生物突变的自发性和不对应性证明,（五）、基因突变的分子基础1.诱发突变（induced mutation）通过人
18、为的方法利用物理、化学、生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。诱变剂：凡具有诱变效应的任何因素。,碱基的置换 仅涉及一对碱基被另一对碱基所置换，属点突变 转换(transition)：嘌呤之间置换或嘧啶之间的置换。置换 颠换(transversion)：嘌呤和嘧啶之间的置换。,诱发突变包括：,引起置换的诱变剂：直接：直接与核酸的碱基发生化学反应的化学诱变。如亚硝酸、羟胺、环氧乙酸等间接：通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子引起突变。如碱基类似物8-氮鸟嘌呤、5-氨基尿嘧啶等,移码突变 诱变剂使DNA序列中的一个或少数几个碱基发生增添（插入）或缺失，从而使后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，
19、引起转录和转译错误的突变。正常：GCG ATC CGT AAC CTG ATG GTT AAC插入：GCT CGA TCC GTA ACC TGA TGG TTA AC缺失：GCA TCC GTA ACC TGA TGG TTA AC引起移码突变的诱变剂：吖啶类染料如吖啶橙等,染色体畸变（chromosomal aberration）诱变剂引起DNA分子的大损伤，导致染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位等变化和染色体数目的改变。诱变剂：理化因子：X-ray、烷化基、亚硝酸、秋水仙素。生物因子如转座子,自发突变 指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变自发突变的原因：由背景辐射和环境因素
20、引起，如天然的宇宙射线等。由微生物自身有害代谢产物引起，例如过氧化氢等。由DNA复制过程中碱基配对错误引起。碱基错配频率为10-710-10。,（六）、DNA损伤的修复 紫外线对DNA的损伤 主要引起相邻嘧啶发生光化学反应形成嘧啶二聚体（TT、TC、CC）和水合物，造成局部DNA分子无法配对，从而引起微生物的死亡或突变。DNA损伤类型很多，微生物对其修复的方法也各不相同。,光复活作用（photoreactivation）最早是AKelner(1949年)在Streptomyces griseus(灰色链霉菌)中发现。光复活作用：把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，就可出现明显降低其死亡
21、率的现象。修复机理 在黑暗下，嘧啶二聚体和光解酶(光裂合酶)结合，形成DNA酶复合物，在300500 nm可见光下，酶获得光能激活，使二聚体重新分解成单体，同时，光解酶与复合物分解，重新执行功能。,光解酶(photolyase):相对分子质量为5.5 104-6.5 104(随菌种不同而略有差异)。含两个辅助因子FADH，8-羟基脱氮核黄素或次甲基四氢叶酸,切除修复(excision repair)又称 暗修复（dark repair）不依赖可见光，通过酶切作用去除嘧啶二聚体，重新合成一段正常DNA链的修复 方式。,暗修复的机理内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5-侧切开一个3-OH和5-P的单链缺
22、口；外切核酸酶从5-P至3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口；DNA聚合酶以DNA的另一条链为模板，从原有链上的3-OH端起逐个延长，重新合成一条缺失的DNA链；通过连接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3-OH末端与原链的5-P末端相连接，从而完成了修复作用。,优良菌种选育的意义：为生产提供了各种类型的突变株，大大提高了菌种产生有利用价值代谢产物的水平，还可以改进产品质量，去除不需要的代谢产物或产生新的代谢产物另外，通过菌种选育可以研究菌种的分子生物学和分子遗传学,二、突变与育种,经典育种方法：自然选育、诱变育种较定向的育种方法：杂交育种、原生质体 融合、基因工程,优良菌种选育的技术手段：,（一）
23、、自发突变育种 选育 微生物在自然以10-6的突变率发生自发突变。定向培育定向培育 利用微生物的自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株方法。如：卡介苗的培育,（二）、诱变育种 诱变育种是指利用诱变剂处理微生物细胞群，提高微生物的突变率，以便采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株进行育种的方法。,1、诱变育种的基本环节,诱变育种的一般步骤,出发菌株培养液细胞或孢子悬液诱变处理平板分离 初筛 复筛,保藏及扩大试验,纯化、同步培养,离心收集细胞，洗涤，制菌悬液，玻璃珠打散，过滤,活菌计数，诱变预备试验,存活细胞计数，致死率计算,变异率计算,
24、2、诱变育种中的原则（1）选择简便有效的诱变剂 化学诱变剂:N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)物理诱变剂:紫外线为最简便 生物诱变剂:溶原性噬菌体,（2）、挑选优良的出发菌株 生产中的自发突变菌株具优良性状的菌株，如生长快、营养要求低等已发生过突变的菌株对诱变剂敏感性高的增变变异株,（3）、处理单细胞或单孢子悬液 容易分散，每个细胞可均匀接触诱变剂 防止长出不纯菌落 产生菌落不纯的原因：某些微生物细胞是多核的 突变的性状在当代不表达产生表型,（4）、选用最适的诱变剂量 突变率随剂量的增加先提高再下降。低剂量易发生正变，高剂量易出现负变多次诱变提高了产量的菌株更容易出现负变。,（5）、充
25、分利用诱变剂复合处理的协同效应复合处理方法同一诱变剂的重复使用两种或多种诱变剂的先后或同时使用,（6）、利用和创造与产量相关的指标（7）、设计高效筛选方案（8）、创造新型筛选方法,3、突变株的筛选（1）、产量突变株的筛选 根据突变株的产物特性来确定具体的筛选方法。,（2）、抗药性突变株的筛选 抗药性基因是一种选择性遗传标记，同时，有些抗药菌株还是重要的生产菌种。梯度平板法是定向筛选抗药性突变株的有效方法。,（3）、营养缺陷型突变株的筛选 几个概念基本培养基(MM)：仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基，称基本培养基。不同微生物的基本培养基是很不相同的。完全培养基(CM)
26、：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称完全培养基。补充培养基(SM)：凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基称补充培养基。,野生型(wild type)：从自然界中分离到的任何微生物在其发生人为突变前的原始菌株，称野生型菌株，简称野生型。如leu+营养缺陷型（auxotroph）：野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株。如leu-原养型（prototroph）：营养缺陷型突变菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。如leu+,营养缺陷型的筛选的程序与
27、方法诱变剂处理 淘汰野生型：抗生素法或菌丝过滤法 抗生素法：抗生素(青霉素)能抑制细菌细胞壁的生物合成，可杀死能正常生长繁殖的野生型细菌但无法杀死处于休止状态的营养缺陷型细菌。菌丝过滤法：适用丝状真菌和放线菌。其原理是在基本培养基中，野生型菌株的孢子能萌发成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。将诱变剂处理后的孢子放在基本培养基上培养后，过滤，重复数遍，可去除野生型菌株。,检出缺陷型通常采用影印平板法,用生长谱法鉴定营养缺陷型生长谱法：是指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，观察营养物的周围有否长菌来确定该供试菌的营养要求的方法。如某一营养物的周围有生长圈，供试菌就是该营养物的缺陷型突变株。,生长
28、谱法鉴定缺陷型,诱变育种的整个过程主要是诱变和筛选的不断重复，直到获得比较理想的高产菌株。诱发突变是使用诱变剂促使菌种发生突变，所以诱发所形成的突变与菌种本身的遗传背景、诱变剂种类及其剂量的选择和合理使用方法均有密切关系，这三者是诱变部分的关键所在。,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因转移与重组原核生物的基因重组的特点为：片段性，仅一小段DNA序列参与重组；单向性，即从供体菌向受体菌(或从供体基因组向受体基因组)作单方向转移；转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。,、转化(transformation)1.定义转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象，
29、称为转化或转化作用。转化子：通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子。,2转化微生物的种类原核微生物肺炎链球菌 Streptococcus pneumoniae嗜血杆菌属 Haemophilus芽孢杆菌属 Bacillus根瘤菌属 Rhizobium假单胞菌属 Pseudomonas黄单胞菌属 Xanthomonas真核微生物酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae()、粗糙脉孢菌 Neurosporacrassa黑曲霉 Aspergillus niger,3.感受态(competence)感受态是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。两个菌种或菌株间能否
30、发生转化，依赖于亲缘关系,但是凡能发生转化，受体细胞必须处于感受态。不同微生物感受态细胞出现的时期不同：如SPneumoniae在指数期后期，Bacillus sp.在稳定期不同微生物感受态细胞在群体中占的比例不同如枯草芽孢杆菌：20左右 流感嗜血杆菌：100不同微生物感受态细胞维持感受态的时间不同 如枯草芽孢杆菌感受态维持几小时 流感嗜血杆菌仅维持数分钟。,4.感受态因子 细菌生长到一定时期，分泌出特异性蛋白来调节细胞处于感受态的蛋白称感受态因子。主要成分：膜相关DNA结合蛋白细胞壁自溶素核酸酶,5.转化因子 转化因子的本质是离体的DNA片段。转化因子的类型dsDNAssDNA质粒DNA在不
31、同的微生物中，转化因子的形式不同：G细菌(Haemophilus)：dsDNAG细菌(Streptococcus)：ssDNA,6.转化过程 供体菌strR dsDNA与感受态受体菌strS细胞表面的膜连DNA结合蛋白相结合，其中一条进入细胞；供体菌的ssDNA片段被细胞内的特异蛋白RecA结合后，与受体菌核染色体杂合DNA区段；杂合DNA区随受体菌染色体组进行复制；细胞分裂后，形成一个转化子(strR)和一个具原来基因型(strS)的子代。,Bacterium undergoing transformation,影响转化率的因素：受体细胞的感受态：决定转化因子是否可进入受体细胞受体细胞的限制
32、性内切酶系统和核酸酶：决定转化因子在整合前是否被分解受体和供体染色体的同源性：决定转化因子是否整合。,二、转导(transduction)1.定义转导：通过缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。转导子：通过转导方式而形成的杂种后代，称转导子。,The mechanism of generalized transduction.In reality,only a very small minority of phage progeny(1 in 10,000)carries donor genes,2.转导的种类（
33、1）普遍转导 通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍转导。又可以分为：完全普遍转导和流产普遍转导,完全普遍转导 噬菌体病毒外壳把完全不含自身DNA的供体DNA“误包”成完全缺陷型噬菌体。当其感染寄主后，寄主细胞不能被溶源化，不显示其对噬菌体的免疫性，以及发生溶菌裂解和产生正常的噬菌体后代。,完全普遍转导,流产普遍转导 简称流产转导(abortive transduction)、经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制、也不迅速消失，而表现稳定的转录、转译和性状表达，这一
34、现象就称流产转导。,流产普遍转导,（2）局限转导(restricted transduction)通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。又可分为：低频转导：形成少数转导子，10-410-6高频转导：50%的转导子。,Gal：发酵半乳糖的基因,Bio：合成生物素的基因,局限转导特点：只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因，一般为噬菌体整合位点两侧的基因；特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；缺陷噬菌体的形成是由于它在脱离宿主核染色体过程中，发生低频率的误切而形成；局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的诱导并引起裂解后
35、才产生。,3、溶源转变,当正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上，而使宿主获得了除免疫性外的新遗传性状的现象，称溶源转变。,溶源性细菌,溶源转变与局限转导，但本质上不同：溶源转变不携带任何外源基因的正常噬菌体；赋予宿主新性状是噬菌体的基因，不是供体菌的基因；新性状是宿主细胞溶源化时的表型，溶源化后形成溶源性细菌，而不是经遗传重组形成的稳定转导子；溶源转变获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失。,三、接合(conjugation)定义与证据定义接合：通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。接合：供体菌(“雄性”)通过性菌毛与受体菌(“雌性
36、”)直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得新遗传性状的现象，称为接合。接合子：通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，称为接合子能进行接合的微生物主要是细菌和放线菌，以G-细菌最为普遍。,证据,G-菌和G+菌的质粒均可发生自我转移，但是G+菌的转移区比G-菌小，接合时不需要伞毛，但需要外激素,2、EColi 接合型菌株的类型 根据F质粒在细胞内的存在方式，可把Ecoli分成4种不同接合型菌株。F菌株：即“雄性”菌株 细胞内存在一至几个F质粒，细胞表面着生一至几条性菌毛的菌株。F-菌株：即“雌性”菌株 细胞中无F质粒、细胞表面也无性菌毛的菌株。当F菌株与F菌株接触时
37、，通过F菌株性菌毛的沟通和收缩，F质粒由F菌株转移至F-菌株中，同时F菌株中的F质粒也获得复制，两者都为F菌株。,F质粒DNA接合转移具体过程：在F菌株F质粒DNA的一条单链特定位点（又称转移起始点，ori T）上产生裂口。,F菌株F质粒DNA,两条DNA链分开，断裂的单链(B)逐步解开，留存的环状单链(A)以“滚环式”复制互补单链(A)。,含裂口的单链(B)以5端为先导，以线形方式经过性菌毛而转移到F-菌株。,在F-中，线形外源DNA单链(B)合成互补双链(B-B)，经环化后，形成新的F质粒，完成F-至F+的转变。,Hfr菌株(高频重组菌株，high frequency recombinat
38、ion strain)细胞中F质粒从游离态转变成核染色体组特定位点上的整合态，菌株与F-菌株相接合后，发生基因重组的频率非常高，所以称为Hfr菌株。F菌株：当Hfr菌株细胞内的F质粒因不正常切离而脱离核染色体组时，可重新形成游离的、但携带整合位点邻近一小段核染色体基因的特殊F质粒，称F质粒或F因子。凡携带F质粒的菌株，称为F菌株。,Hfr菌株的染色体向F-菌株的转移过程与F质粒自F+转移至F-基本相同，都是按滚环模型来进行的。不同的是进人F-菌株的单链染色体片段经双链化后，形成部分合子（merozygote,即半合子），然后两者的同源区段配对，经双交换后，才发生遗传重组。,接合过程一般可分为：
39、Hfr与F-细胞配对。通过性菌毛使两个细胞直接接触，并形成接合管；Hfr的染色体在起始子(i)部位开始复制，至F质粒插入的部位才告结束；供体DNA的一条单链通过性菌毛进入受体细胞。发生接合中断，F-成了一个部分双倍体，在那里，供体细胞（Hfr）的单链DNA片段合成了另一条互补的DNA链。外源双链DNA片段与受体菌（F-）的染色体DNA双链间进行双交换，从而产生了稳定的接合子。,转导、转化、接合的总结,四、原生质体融合,原生质体融合（protoplast fusion）：通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程，称为原生质体融合。由原生质
40、体融合获得的重组子，称为融合子(fusant)。,原生质体融合的一般步骤,制备原生质体原生质体融合原生质体再生筛选融合子,二、真核微生物的基因转移与重组,基因重组方式：有性生殖准性生殖原生质体融合遗传转化,（一）、有性杂交1、定义有性杂交，指不同遗传型的性细胞间发生接合和进行染色体重组产生新的遗传性状后代的育种技术。能产生有性孢子的微生物均能进行有性生殖。,2、有性杂交育种 将不同性状的两菌株（双倍体）诱导产生有性孢子（单倍体），将有性孢子在平板上培养产生单倍体细胞菌落。把来自不同亲本、不同性别的单倍体细胞接触，产生双倍体杂交后代，从子代中选育出优良性状的杂种。,（二）、准性杂交(parase
41、xual hybridization)1、准性生殖 指同种微生物不同菌株的体细胞间发生融合，不通过减数分裂发生低频率基因重组，并产生重组子的生殖方式。,2、准性生殖的过程菌丝融合：在形态无区别、遗传型有差别的同种微生物不同菌株的体细胞(单倍体)的菌丝间接触融合。发生频率极低。形成异核体：菌丝融合后，发生质配，使两个单倍体核集中到同一细胞中，形成了双相的异核体。杂合二倍体的形成：异核体两个不同细胞核发生核融合(核配)，产生双倍体杂合子核。频率非常低。双倍体核一旦形成，就会很稳定，并分裂产生更多的双倍体核。体细胞交换在有丝分裂中，双倍体核中同源染色体间偶尔也会发生交联，几率也很低，但同样会产生染色
42、体重组体细胞交换即体细胞中染色体间的交换，也称有丝分裂交换。单倍体化：双倍体杂合子的遗传性状不稳定，进行有丝分裂时，核内的染色体偶尔发生交换和单倍体化，形成具有新性状的单倍体杂合子。,在双倍体核的分裂过程中，偶尔发生染色体的非二等份分离，结果产生非整倍体(aneuploid)子核，一个子核含有2n+1条染色体，另一个子含有2n-1条染色体。非整倍体核是不稳定的，在随后的分裂过程中会丢失染色体直到回复到整倍体含2n+1条染色体的细胞核丢失一条染色体而变为2n条，含2n-1条染色体的核将逐渐回复为含n条染色体的单倍体核，从而实现单倍体化。,3、准性杂交育种 微生物准性生殖主要发生在一些不产生有性孢
43、子的真核微生物的杂交过程，进行育种。,第四节 菌种衰退、复壮和保存,菌种是从事微生物学及生命科学研究的材料，特别是生产抗生素、氨基酸、酿造等工业，离不开菌种。菌种保存是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。首要任务就是使菌种不死亡，同时还要尽可能使菌种优良性状保持下来，而不向不利于方面转化。保存菌种不变异是不可能的事，没有一种方法可使其绝对不变，研究菌种保存就是要采样最合适的方法保存，使菌种的变异和死亡减少到最低程度。,一、菌种的衰退与复壮,衰退由于自发突变的结果，而使某物种原有一系列生物学性状发生质变成量变的现象。具体表现：原有形态性状变得不典型，如Bacillus thuring
44、iensis（苏云金秆菌）的芽孢和伴肥晶体变小或丧失。生长速度变慢，产生孢子变少代谢产物能力下降，即“负变”致病菌对寄主侵染力的下降对外界不良条件包括低温，变温等抵抗能力的下降衰退是一个由量变到质变的过程，开始是个别细胞发生自发突变，经一代代传递，导致在种群种扩大，发展为优势种群，从而使整个群体表现出严重衰退。,复壮狭义复壮是一种消极措施是指菌种在已发生衰退的情况不经过纯种分离和测定典型性状，产生性能等指标，从已衰退的的种群中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。广义复壮一种积极措施，即有菌种的典型特征或生产性状尚未衰退之前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作
45、，以期从中选择到自发的突变体。,衰退的防止,控制传代次数 突变几率：10(-8)10(-9)创造良好的培养条件 发现创造一个适合原种的生长条件，可在一定程度上防止衰退 如：赤霉素生产菌G.fujikuroi加入糖蜜、天冬酰胺、5核苷酸或甘露醇等丰富有机营养物时，有防止衰退效果。在Aspergillus terricola(栖土曲霉)培养时，提高培养温度从28-3033-34时，可防止产孢子能力的衰退。,利用不易衰退的细胞传代在放线菌或霉菌中，菌丝含有多个细胞核，甚至有异核体，用菌丝接种就易出现变异或衰退，而孢子是单肥单核就不会出现在实践中用棉花蘸放线菌孢子斜面接种。有些霉菌如用分生孢子传代易于
46、衰退而用子代孢子接种则可避免退化,采用有效的菌种保藏方法不同的菌种采用不同的保存方法，可有效地降低菌种的衰退速度,（二）、菌种的复壮,纯种分离法纯种分离法有“菌落纯”水平（pure culture in colony level）和“菌株纯”水平（pure culture in strain level）分离法菌落纯（菌种纯）包括平板表面涂布法，平板划线分离法，琼脂培养基浇注法细胞纯（菌株纯）包括用分离小室进到单细胞分离，用显微镜从皿进到单细胞分离，用菌丝尖端切割法进到单细胞分离,通过宿主体复壮淘汰已衰退的个体若对某些微生物用分子孢子采样特殊的低温处理，其死亡率达80,二、菌种的保存,菌种保存
47、的原理根据菌种的生理生化特点人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于休眠状态，抑制其繁殖能力。,斜面冰箱保存法：用新鲜斜面培养基接种后，置最适条件下等菌体或孢子长满后，冰箱4保存，一般保存36个月。,沙土管保存法：沙土洗净烘干过筛，2：1混匀，分装小试管，高度1cm，121间歇灭菌三次，烘干备用，一般用80100目过筛土。用斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下，直接与沙土混合，置干燥皿中真空泵抽干，冰箱保存，一年左右。,菌丝速冻法对不产孢子或芽孢的微生物，不能用沙土管保存，可采用菌丝速
48、冻法保存温度-20，为避免微生物受损致死，需要甘油作保护剂，浓度25。具体操作：配制50甘油溶液，121灭菌备用制备菌悬液：浓度1081010菌悬液和甘油溶液以等体积混合均匀，-20保存,石蜡油封存法向培养成熟的菌种斜面上倒一层灭过菌的石蜡油，用量及斜面1cm，保存于冰箱中。此法适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌，霉菌，酵母等微生物的保存，一年左右。,真空冷冻干燥保存法原理在较低的温度下（-18），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。微生物的生长代谢暂时停止，不易发生变异。可保存很长时间，一般5年左右。,基本操作：将微生物制成悬液，再与保护剂混合放在特制安瓿管中，用低温酒
49、精或干冰，使其迅速冻结，用真空泵抽干。将安瓿管真空熔封，并低温保存。可加适当的保护剂：脱脂牛奶或血清作用：冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型，防止细胞膜因冻结而破坏。起支持作用，使微生物疏散地固定在上面。,液氮超低温保存法原理：保存温度-196，远低于微生物新陈代谢作用停止的温度-130。所以菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。适用广泛，尤其是不产孢的菌丝体，保存方法理想，保存期最长。,操作方法菌种准备及分装需保护剂，常用10的甘油，制备好0.21ml的装量。冻结（关键）先把微生物从常温过渡到低温，这样使细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其温冷形成结
50、晶而伤害细胞。如美国ATCC导用先将菌液降低到0，然后以1/min下降，一直降低到-35，然后才把装有菌液的安甑管放入液N罐中。重新培养当要使用或检查所保存菌种，可将安瓿瓶从冰箱中取，室温或3545水浴中迅速解冻，当升到0时即可打开安瓿瓶，将菌种移到适宜的斜面培养基上。安瓿管要求：所用的管需能承受大的温差而不至于破裂，贴好标签。,国内外主要菌种保存机构,ATCCAmerican Type Culture Collection 美国标准菌株收藏所，美国马里兰州罗克维尔市。CSM冷泉港研究室，美Cold Spring Harbar LaboratoryAM日本东京大学应用微生物研究所，日本东京，I
