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1、第四章蛋白质聚糖的相互作用关锋,历史背景,有关聚糖-蛋白质相互作用的许多早期工作都是围绕酶对聚糖的识别展开的，如糖原和淀粉的合酶和磷酸化酶。Fleming、Chain和Florey因发现溶菌酶和青霉素的抗菌作用而获得1945年诺贝尔奖。,溶菌酶-内切糖苷酶，专一裂解肽聚糖中的1-4键。,卢伊斯弗德里科莱洛伊尔（Luis Federico Leloir)研究了糖核苷酸及其在碳水化合物合成中的作用(复杂的糖类分解为简单碳水化合物的过程)而获1970年诺贝尔化学奖,20世纪60年代末，Phillips及其同事们从溶菌酶与四糖形成的复合物中获得了溶菌酶的三维结构。,ConA1972年和1981年分别报
2、道聚糖结合蛋白的三维结构和流感病毒血凝素的晶体结构。Lemieux及其同事在凝集素和抗体与特异血型抗原的结合位点研究中，获得了促进该领域发展的关键信息。,蛋白质对聚糖的识别,蛋白和聚糖的结合力和任何配体与受体之间的结合力，包括：氢键，范德华力，电荷以及偶极吸引力都是一样的。,“水问题”,大多数为研究聚糖-蛋白质结合能量学的尝试都集中在计算单一的参与因子，譬如测定配体的优势构象，或估测聚糖与蛋白质结合位点中功能基团间近程相互作用等。,聚糖-蛋白质在水中的结合引起水分子移位的示意图。,从熵值来看，溶剂化/去溶剂化的能量很大，对糖这样一类化合物很难准确地计算。因此尽管结合位点是以范德华力和氢键相互作
3、用，能量贡献可以估测，但因估测参与溶剂化反应变化的误差可能很大，给结合能量的整体计算带来了困难，这就是“水问题”造成的。,霍乱毒素与GM1五糖结合的原子细节,利用X射线晶体学解析了与蛋白质结合的聚糖表面的一种共有性结合模式，即约300-4002，相当于2.5个糖残基与蛋白质接触。,GM1结构,结合霍乱毒素GM1五糖的简化结构图中示出了霍乱毒素直接或通过水分子氢键与聚糖接触的氨基酸残基。,聚糖-蛋白质相互作用的动力学,除界定聚糖结合蛋白质三维结构外，界定其与各种聚糖的特异性相互作用也很重要。一种凝聚素（L）或抗体（G）的结合服从简单的方程式4.1。其中亲和常数K由方程式4.2定义为结合常数，因此
4、K也等于k1/k2,K与在pH7进行的结合反应标准自由能变化G0(4.3)有关。,4.1,4.2,4.3,其中R为气体常数0.00198kcal/mol-度，T是绝对温度298K。亲和常数K也与方程式4.4中热力学参数有关，其中G、H和S各自代表结合反应的自由能、焓和熵的变化。G=H-TS=-RTlnK,显然，对每一项研究中特定的结合现象，有必要界定其K、k1、k2、G、H和S参数，但研究者们往往只简单地设法界定K常数。研究聚糖和蛋白质结合有多种不同方法，从热力学的严格性、聚糖和蛋白质的用量以及分析速度各方面比较，每一种方法均有其长处和不足。,X-射线衍射和核磁共振,核磁共振是测定溶液中生物分
5、子结构的优选方法。一般来说，单糖是既小而又较刚性的分子，但组装起来的聚糖，由于其围绕糖苷键的选装自由度而具有较大的柔性。在核磁共振中，应用多维技术如NOE（Nuclear Overhauser Effect），遵从质子共振的分配能够预测出质子-质子间的距离，这一信息再与计算机数学建模的计算技术相结合，便可预测出游离态寡糖在溶液中的构象，应用转移NOE有可能把这种信息推广用于测定聚糖与蛋白质在溶液中的相互作用。,平衡透析,平衡透析方法是将聚糖结合蛋白浓溶液(凝集素和抗体)放入可渗透到配体（聚糖或小分子半抗原）的透析室，然后把透析室置入已知体积的含有浓度范围为1/K的聚糖缓冲液中平衡，在平衡状态下
6、，结合的聚糖浓度加上袋内游离聚糖浓度（In）和袋外游离聚糖的浓度(Out)将取决于袋内蛋白质的浓度和亲和力，由此可测定聚糖-蛋白质之间的相互作用。,优点：1.方法简单，不需精密仪器。2.高亲和力情况下，蛋白需求量小。3.高亲和力情况下，所需半抗原也少。4.蛋白质和抗原均很稳定时，可回收重复利用。5.可应用具有放射活性的半抗原。6.平衡测定结果可靠。缺点：1.只能得出K（结合常数）值。2.低亲和力时，蛋白质和半抗原需要量较大。3.要做多次不同的测定，耗时较长。,亲和层析,亲和层析是将凝聚素固定到一种亲和载体上（如Affi-GelTM），将含有聚糖的缓冲液加入固定的凝聚素中，根据洗脱谱型测定与凝聚
7、素的结合。如果聚糖与固定的凝聚素结合相对牢固，可加入含有某种已知半抗原缓冲液使复合物解离，在这种情况下，可以估定凝聚素的结合特异性及其近似的结合亲和力，因为固定化凝聚素的浓度是已知的，其结合容量也可以界定。,一种更为精细的方法是前沿亲和色谱分析法，是将含有已知浓度的聚糖样品加到固定了聚糖结合蛋白的柱上，监测从层析柱中洗脱下来的聚糖（洗脱前沿）。为此，持续地将配体加到柱上，也就是当配体开始在洗脱液中出现时，代表洗脱前沿的体积即为配体结合亲和力的一次度量。,VfT/Vt为柱的结合容量；Vf为前沿体积；Vt为层析柱的总体积；O为所添加溶液中聚糖的浓度；L为基质中凝集素浓度。用不同的聚糖浓度可得到一系
8、列洗脱曲线图，并可得出50%的饱和点。,亲和层析举例，图中表示用不同浓度的聚糖上样于固定化凝聚素层析柱。最低浓度时（D），聚糖洗脱延迟，层析前沿用垂直线表示。浓度渐增（CA），聚糖提前洗脱。,滴定量热法,可用商品微量热量仪，以等温滴定量热法测定自由能变化进行聚糖与凝聚素结合的研究。具体：用一注射器将含有测试聚糖的溶液加到微量热仪混合池中含固定浓度凝聚素的溶液内。加到对照实验混合池内的溶液不含蛋白质。按一定时间间隔，分多次加入1-3ul的聚糖溶液，测量由结合反应释放出的热量，然后作图分析。,优点:提供有关聚糖结合到聚糖结合蛋白上的所有重要热力学数据，远远优于平衡层析和亲和层析方法。缺点:1.蛋白
9、质用量较大。2.聚糖用量也大。3.这类分析方法不能有代表性地利用范围广泛的不同的聚糖。,表面激元共振,表面激元共振（SPR）是由某种游离分子（分析物）与传感器芯片上固定的配体相结合而引发芯片表面折射率变化的一种技术。这一方法是测定表面层的折射率变化，并记录为SPR信号或共振单位（RU）。,SPR方法中，对分析物与固定配体结合引发的反射光变化及其测定。,优点：1.可测定从mmol到pmol范围的亲和力。2.可常规进行k1和k2（方程式4.1）的全测定。3.对于采用氨基偶联分子的固定化，正常情况下用量很少。4.测定速度快，全部实验结果可在几天内完成。缺点：1.要求分析物要有足够大的质量（2000Da）。2.由于质量输送效应，使分析物可在固相表面再结合，导致在仪器上可能出现某些非均一性。,其他方法,诸如酶联免疫吸附测定（ELISA）、IC50-半抗原抑制、沉淀、电泳、配体和受体cDNA的表达等等，都可对聚糖-蛋白质的相互作用进行测定，各有优缺点，需根据实际情况采用合适的方法。,
