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1、组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响,背景,肿瘤已成为人类健康的头号杀手，肿瘤的治疗研究也是生物医学领域一个炙手可热的方向。,*由于肿瘤抗原的存在，势必被机体免疫系统所识别，并由此激发特异性免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫。*在细胞免疫方面，T淋巴细胞、K细胞（抗体依赖性细胞毒细胞）、NK细胞（自然杀伤细胞）和巨噬细胞对肿瘤细胞均具杀伤作用。*肿瘤的体液免疫主要是抗肿瘤抗体对肿瘤细胞的破坏效应。,研究现状,从香菇的子实体提取物中获取的主要有效分香菇多糖，作为一种天然的免疫调节剂，对各种恶性肿瘤有较好的防治作用1。香菇多糖在实验动物中有促进B淋巴细胞的分化、增殖，增强免疫功能的作用2,3
2、。Mushiake等4的研究结果还表明：香菇多糖能通过改善树突状细胞的功能，调节DCs介导的特异性免疫，增强抗瘤活性，最终提高荷瘤鼠的存活率。,树突状细胞与抗癌树突状细胞,树突状细胞来源人树突状细胞起源于造血干细胞。DC的来源有两条途径。,树突状细胞与抗癌树突状细胞,树突状细胞主要功能机体功能最强的专职抗原递呈细胞(APC),树突状细胞与抗癌树突状细胞抗肿瘤,外周DCs可迁入胸腺，以便更高效率地诱导T细胞分化增殖，由它激活的细胞免疫应答在机体抗肿瘤中起主导作用6,7。1、MHC-类和MHC-类分子抗原呈递分子共刺激分子第二信号2、DC与T细胞结合IL-12、IL-18T细胞增殖，诱导CTL生成
3、，主导Th1型免疫应答，利于肿瘤清除；激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用；3、趋化因子(CCK)：CD4+T趋化、长期存在；正反馈旁分泌方式活化DC；某些抗血管生成物质(如IL-12、IFN-)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。CD8+T,香菇多糖与DC香菇多糖,香菇多糖活性成分：(13)D 葡聚糖,香菇多糖与DC香菇多糖抗肿瘤,本实验将通过观察胸腺结构，S100和CD1a免疫组化标记（S100标记成熟的TDCs，用CD1a标记未成熟TDCs。），计算S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比，计算TDCs密度，测算胸腺指数、肿瘤指数、抑瘤率等指标，探讨
4、香菇多糖对荷瘤小鼠S100+胸腺树突状细胞(TDCs)和CD1a+TDCs表达的影响。原创点：阐明香菇多糖能增加TDCs数量及促进其分化成熟。,实验设计,实验室要求实验步骤观察指标统计分析预期实验结果,实验室要求,实验仪器实验对象药品试剂,实验室要求实验仪器,SABC试剂盒精密天平组织匀浆机泡沫盒放液氮的小型保温杯或者液氮罐血球计数板进口样本冻存管50个小鼠取组织学标本用手术器械2套1ml注射器 30支DT2000图像分析软件V2.0统计分析软件SPSS19.0,实验室要求实验对象,清洁级ICR小鼠，雌雄各半，20-25g，60只（由浙江大学实验中心提供）,实验室要求药品试剂,小鼠S180细胞
5、株兔抗小鼠S100兔抗小鼠CD1a注射用香菇多糖环磷酰胺4%甲醛固定液 1500ml组织固定用250ml 4%甲醛2瓶（敞口瓶+瓶盖）生理盐水1000ml液氮 5 L,实验方法,荷瘤S180鼠模型的建立动物分组普通光镜检查免疫组织化学标记和观察分析胸腺指数，肿瘤指数，抑瘤率的计算,实验方法荷瘤S180鼠模型的建立,取已接种7 d肿瘤生长良好的S180腹水型小鼠，抽吸乳白色的浓稠腹水以无菌生理盐水稀释后，用血球计数板进行活细胞计数，调整细胞数为1107，制成肿瘤细胞悬液(活细胞率95%)。在小鼠右前腋皮下注射0.2 ml S180细胞悬液，制成实体瘤模型。,实验方法动物分组,实验方法普通光镜检查
6、胸腺结构,小鼠断头处死，剥离胸腺组织，称重后入4%多聚甲醛溶液中固定。低温石蜡包埋制片，HE染色，显微镜观察。,实验方法免疫组织化学标记和观察分析,将胸腺石蜡标本制成厚4m的石蜡切片。0.1%胰蛋白酶消化30 min(37)，一抗4过夜(S100和CD1a工作浓度均为1150)。按试剂盒作SABC免疫组化技术处理。DAB显色。阴性对照：以PBS代替一抗。用DT2000图像分析软件V2.0计数单位面积胸腺切片中阳性颗粒的个数和面积，计算S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比。使用DigiLab 2.0、Motic Images Plus 2.0 ML软件计算TDCs密度：每组随机选取50
7、个高倍视野拍照(0.068 mm2)，计数S100+细胞的个数。TDCs密度=50个高倍视野S100+细胞总和/3.4 mm2(阳性颗粒最小直径 2m 时认作一个细胞)。,实验方法观测、计算及分析,观测指标肿瘤质量胸腺质量小鼠体质量计算胸腺指数(mg/g)=胸腺质量(mg)/小鼠体质量(g)肿瘤指数(mg/g)=肿瘤质量(mg)/小鼠体质量(g)抑瘤率(%)=(荷瘤模型组肿瘤质量-荷瘤药物实验组肿瘤质量)/荷瘤模型组肿瘤质量100%统计分析采用统计学软件包SPSS19.0，结果用xs表示，各实验组之间的比较采用单因素方差分析，显著性检验水准为=0.05。,预期实验结果,切片观察胸腺结构接种肿瘤
8、小鼠胸腺均萎缩：胸腺皮质变薄，胸腺细胞稀疏，皮、髓质分界不清；胸腺皮、髓质的细胞密度比例降低。而电镜下观察到胸腺细胞退化萎缩，出现了大量的脂肪、纤维、凋亡的胸腺细胞，线粒体肿胀，嵴减少，出现大小不等的空泡，核固缩。萎缩程度：,预期实验结果,HE染色切片观察对比观察免疫组化染色及HE染色切片，可见HE染色中显示的TDCs多数能表达S100和CD1a。S100标记示TDCs胞浆内有深棕色颗粒表达(部分TDCs细胞核也有表达)。CD1a标记主要表达在TDCs细胞膜上，呈棕色阳性反应。环磷酰胺组、荷瘤香菇多糖组胸腺皮质中见大量S100阳性表达的TDCs，髓质有数量较少的TDCs，但细胞体积较大；而正常
9、对照组、荷瘤模型组胸腺髓质S100阳性表达TDCs量很少。,预期实验结果,S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比TDCs密度光镜下药物组TDCs数量明显增加，特别在胸腺皮质密度很高。胸腺指数(mg/g)接种肿瘤小鼠胸腺指数均下降，与正常对照组相比具有统计学意义荷瘤环磷酰胺组小鼠胸腺指数回升，其指数与荷瘤模型组相比具有统计学意义(P0.01)。荷瘤香菇多糖组小鼠胸腺指数回升，其指数与荷瘤模型组相比具有统计学意义(P0.01)。且随浓度升高，指数回升更多，指数更加接近于正常对照组小鼠。肿瘤指数(mg/g)抑瘤率(%),可行性分析,实验动物和实验器材、试剂由实验中心提供，实验时间充裕，经费充
10、裕。实验设计均是基于一定的文献基础，根据前人的实验结果，该实验流程和方法是完全可行的。,讨论,研究表明，香菇多糖具广泛的免疫调节作用，可通过增加脾细胞增殖和IL-2的表达水平，以及通过激活脾细胞受体信号转导等方式增强免疫5。DCs是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，它几乎存在于所有哺乳类动物组织中，通过识别和传递抗原肽给T细胞而参与免疫，外周DCs可迁入胸腺，以便更高效率地诱导T细胞分化增殖，由它激活的细胞免疫应答在机体抗肿瘤中起主导作用6,7。荷瘤机体免疫机制的失能不是由于缺乏肿瘤抗原，可能就是由于DCs的功能缺陷导致这些抗原不能被有效地提呈给T淋巴细胞，从而不能诱导细胞毒性T淋巴细胞产生有
11、效而特异性的免疫应答。,讨论,TDCs有多种在细胞水平标记和识别的方法。通常用S100标记成熟的TDCs，用CD1a标记未成熟TDCs。本实验通过多种树突状细胞标记物联合标记，结合光镜形态观察，表明小鼠荷S180肉瘤后，TDCs数量减少，而在应用香菇多糖后TDCs数量增加。尤其是S100+TDCs，即成熟TDCs增加，且不仅出现在皮质，在胸腺髓质也出现较多体积较大的成熟TDCs。与其他各组比较，荷瘤香菇多糖组TDCs密度增加具有统计意义(P0.01)。,实验讨论,以上结果表明：香菇多糖能增加TDCs数量并促进其分化成熟，增强其抗原提呈能力，从而加强活化T细胞启动细胞免疫功能。这可能是香菇多糖抗肿瘤的机理之一。,
